ヘマグルチニンを発現するトランスジェニック植物において産生された組換え型インフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐ）

专利摘要:
植物内または植物の部分内でインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を合成するための方法が提供される。本方法は、植物内でのインフルエンザＨＡの発現、およびサイズ排除クロマトグラフィーによる精製を伴う。本発明は、インフルエンザＨＡタンパク質および植物脂質を含むＶＬＰにも関する。本発明はさらに、インフルエンザＨＡをコードする核酸ならびにベクターを対象とする。ＶＬＰは、インフルエンザワクチンを処方するために使用されてもよく、または従来型ワクチンを濃縮するために使用されてもよい。
公开号:JP2011509661A
申请号:JP2010542486
申请日:2009-01-12
公开日:2011-03-31
发明作者:フレデリック オルス，；マノン コーチャー，；マルク−アンドレ ダウスト，；ミッシェル ダルギス，；ソニア トレパニエール，；ルイ−フィリップ ベジーナ，；ピエール−オリビア ラボイエ，；ナタリー ランドリー，
申请人:メディカゴ インコーポレイテッド；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 本願は、２００８年７月１１日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１２８１の継続出願であり、このＰＣＴ出願からの優先権を主張する。本願はまた、２００８年１月２１日に出願されたカナダ国出願２，６１５，３７２号、および２００８年１月２２日に出願された米国特許出願第６１／０２２，７７５号からの優先権を主張する。]
[0002] 発明の分野
本発明はウイルス様粒子の生産に関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザ抗原を含むウイルス様粒子の生産に関する。]
背景技術

[0003] 発明の背景
インフルエンザは、呼吸器系ウイルスによるヒトの主要死因である。一般的な症状には、特に、発熱、咽頭炎、息切れ、および筋痛が含まれる。インフルエンザ流行期中、インフルエンザウイルスは世界中で人口の１０〜２０％に感染し、毎年２５０〜５００，０００人の死者を出している。]
[0004] インフルエンザウイルスは、感染した哺乳動物およびトリの細胞の原形質膜から出芽するエンベロープウイルスである。それらは、存在する核タンパク質およびマトリックスタンパク質抗原に基づいて、Ａ型、Ｂ型、またはＣ型に分類される。インフルエンザＡ型ウイルスは、存在する赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）表面糖タンパク質の組合せに従ってさらに亜型に分割される。ＨＡは、ウイルスが宿主細胞に結合し侵入する能力をつかさどる。ＮＡは、宿主細胞およびウイルス表面タンパク質のグリカン鎖から末端シアル酸残基を取り除き、これによりウイルス凝集が防止され、ウイルスの移動性が促進される。現在、１６種のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）および９種のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）亜型が認識されている。各Ａ型インフルエンザウイルスは、１つの型のＨＡおよび１つの型のＮＡ糖タンパク質を提示している。一般的に、各亜型は種特異性を示す。例えば、すべてのＨＡおよびＮＡ亜型は、トリに感染することが公知である一方で、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、およびＮ７亜型のみが、ヒトに感染することが示されている（Ｈｏｒｉｍｏｔｏ ２００６年；Ｓｕｚｕｋｉ ２００５年）。Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９を含むインフルエンザウイルスは、最も病原性の高い型のインフルエンザＡ型ウイルスと考えられており、将来大流行を引き起こす可能性が最も高い。]
[0005] インフルエンザ大流行は、通常、高度に伝染性で病原性のあるインフルエンザウイルスによって引き起こされ、世界的に高いレベルの疾病および死亡に結びつく場合がある。新しいインフルエンザＡ亜型の出現は、結果として２０世紀において４回の主要な大流行をもたらした。Ｈ１Ｎ１ウイルスによって引き起こされた１９１８〜１９１９年のスペインかぜは、１９１７年から１９２０年の間に世界中で５０００万人以上の死亡の原因となった。現在、新しい亜型が出現するリスク、または動物の亜型がヒトに伝染するリスクは、常に存在している。高病原性型のトリインフルエンザ（「鳥インフルエンザ」とも呼ばれる）が、特に懸念されており、その発生は世界中のいくつかの国々で報告されている。多くの場合、この鳥インフルエンザは、結果として４８時間以内に１００％に近い死亡率をもたらす場合がある。トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）は、１９９７年に香港で最初に同定され、他のアジア諸国およびヨーロッパへと広がって行ったことは、野鳥の移動パターンと関連していると想定されている。]
[0006] ヒトのインフルエンザと闘うための現行方法は、毎年のワクチン接種によるものである。ワクチンは、通常、来たるべき「インフルエンザ流行期」の主流菌株であると予測されるいくつかの菌株の組合せである。予測は世界保健機構が調整する。一般的に、各年生産されるワクチン用量数は、世界中の人口にワクチン接種をするほど十分にはない。例えば、カナダおよび合衆国は、それらの人口の約３分の１を免疫するのに十分なワクチン用量を取得するが、欧州連合は、人口の１７％が予防接種を受けることができるに過ぎない。インフルエンザワクチンの現在の世界的生産量は、世界的なインフルエンザ大流行に直面した場合に不十分であろうことは明白である。所与の年に必要な年間生産量をなんとかして満たすことができたとしても、主流菌株は年毎に変化し、したがってその年の低需要時に備蓄することは実際的ではない。有効なインフルエンザワクチンの経済的大量生産は、政府および民間産業にとっても同様に重要な関心事である。]
[0007] ワクチンに使用されるウイルス株は、受精卵で生産される。ウイルス粒子を回収し、不活化ウイルスワクチンの場合は、表面活性剤で破壊して不活化する。弱毒化生ワクチンは、低温での増殖に適応していたインフルエンザウイルスから作製されており、それは、正常体温でワクチンが弱毒化されることを意味する。そのようなワクチンは、５から４９歳の個人における使用が合衆国で認可されている。不活化全ウイルスワクチンは、化学薬品で不活化することにより無害化され、それらは、胚性卵または哺乳動物細胞培養で生産されている。これらのタイプのワクチンはすべて、いくつかの特定の利点および欠点を示す。全ウイルスに由来するワクチンの１つの利点は、そのようなワクチンにより誘導される免疫のタイプである。一般的に、成分ワクチンは強力な抗体反応を誘導するが、全ウイルスから作製されるワクチンは、抗体（体液性）および細胞応答の両方を誘導する。たとえワクチンにより誘導される保護と相関する機能的な抗体応答が、許認可の基準であるとしても、Ｔ細胞応答もインフルエンザ免疫において重要であるという根拠が増加しつつあり、これも、より良好な保護を高齢者に提供することができる。]
[0008] 細胞性免疫応答を誘導するために、全ウイルスから作製されたワクチンが開発された。インフルエンザ菌株（例えば、Ｈ５Ｎ１）は病原性が高いため、これらのワクチンは、ＢＬ３＋施設で生産される。Ｈ５Ｎ１などの高病原性インフルエンザ菌株の場合、いくつかの製造業者は、インフルエンザ菌株の病原性を低減させ、ウイルスを非病原性にし、胚性卵または哺乳動物細胞培養でより容易に生産するために赤血球凝集素遺伝子配列を修飾している。他の製造業者も、高収量低病原性インフルエンザ供与体菌株（Ａ／ＰＲ／８／３４；Ｑｕａｎ Ｆ−Ｓら、２００７年）に、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼタンパク質の遺伝子配列がクローニングされているリアソータントインフルエンザ菌株を使用している。これらの方法は、有用なワクチンを生産することができるが、通常の年の世界的な必要性を満たすのに必要な規模で、大量に低価格で迅速にワクチンを生産する必要性に対する解決策を提供しておらず、大流行に直面した場合に不足することはほとんど間違いないだろう。]
[0009] この逆遺伝子工学を使用して、ウイルスを非病原性にするためにＨＡタンパク質の遺伝子配列を変異させる必要もある可能性がある。高病原性インフルエンザ菌株の場合、全ウイルスワクチンの生産には、封じ込め手順、またはその結果生じるワクチンが循環ウイルスの遺伝子配列と完全には一致しないことが必要とされる。弱毒化生ワクチンの場合、投与されたワクチンが、宿主に由来するインフルエンザウイルスと組換えを起こして、新しいインフルエンザウイルスに結びつく場合があるというリスクがさらに存在する。]
[0010] この方法は、抗原性エピトープおよび翻訳後修飾を維持する一方で、この方法には、全ウイルスを使用することによる汚染のリスク、およびウイルス菌株に依存して収量が変動するというリスクを含む多数の欠点がある。保護が最適レベルを下まわるのは、ウイルスを卵に導入することによるウイルスの遺伝子異質性に起因する場合がある。他の欠点には、卵の取得には綿密な計画が必要であること、精製に使用される化学薬品による汚染リスクがあること、および生産時間が長期間にわたることが含まれる。また、卵タンパク質に過敏な人は、ワクチンを受けるのに適した候補ではない場合がある。]
[0011] 大流行の場合、成分ワクチン生産は、卵での増殖に菌株を適応させる必要性、および達成される生産収量の変動により制限を受ける。この技術は、季節性ワクチンの生産に何年も使用されてきたが、大流行に対して合理的な時間枠の中で対応することが非常に難しく、世界的な生産能力には制限がある。]
[0012] 卵の使用を回避するために、インフルエンザウイルスは、哺乳動物細胞培養、例えばＭＤＣＫまたはＰＥＲＣ．６細胞などでも生産されてきた。別の手法は、ウイルス遺伝子を有する細胞形質転換によりウイルスが生産される逆遺伝学である。しかしながら、これらの方法には、全ウイルスの使用、ならびに綿密な方法および特異的な培養環境が必要とされる。]
[0013] いくつかの組換え産物が、組換えインフルエンザワクチン候補として開発されている。これらの手法は、インフルエンザＡ型ＨＡおよびＮＡタンパク質の発現、生産、および精製に注目しており、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞を使用したインフルエンザＡ型ＨＡおよびＮＡタンパク質の発現（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９９９年；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、１９９９年）、ウイルスベクター、ならびにＤＮＡワクチン構築物（Ｏｌｓｅｎら、１９９７年）を含む。]
[0014] インフルエンザウイルス感染の詳細は周知である。手短かに言えば、感染サイクルは、ビリオン表面ＨＡタンパク質が、シアル酸含有細胞受容体（糖タンパク質および糖脂質）に結合することにより開始される。ＮＡタンパク質は、シアル酸受容体のプロセシングを媒介し、細胞へのウイルス侵入は、ＨＡ依存性受容体媒介性エンドサイトーシスに依存する。インフルエンザビリオンを含有する内在化エンドソームの酸性限界では、ＨＡタンパク質は、ウイルスと細胞膜とが融合し、ウイルスが脱外被し、ヌクレオカプシド関連リボ核タンパク（ＲＮＰ）から、Ｍ２の媒介によりＭＩタンパク質が放出されて、それらがウイルスＲＮＡを合成するために細胞核へ移動することに結びつく構造変化を起こす。ＨＡタンパク質に対する抗体は、ウイルス感染性を中和することによりウイルス感染を防止するが、ＮＡタンパク質に対する抗体は、ウイルス複製の初期段階に対するそれらの影響を媒介する。]
[0015] Ｃｒａｗｆｏｒｄら（１９９９年）では、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるインフルエンザＨＡの発現が開示されている。発現されたタンパク質は、トリＨ５およびＨ７インフルエンザ亜型により引き起こされる致死性インフルエンザ疾患を予防可能であると記述されている。Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（１９９９年）では、バキュロウイルスで発現されたインフルエンザＨＡおよびＮＡタンパク質が、従来のワクチンによって誘導される免疫応答より優れた免疫応答を動物に誘導することが教示されている。バキュロウイルスで発現されたウマインフルエンザウイルス赤血球凝集素の免疫原性および効力が、相同性のＤＮＡワクチン候補と比較された（Ｏｌｓｅｎら、１９９７年）。まとめると、これらのデータは、インフルエンザウイルスによる免疫誘発に対する高度な保護が、種々の実験手法を使用して、異なる動物モデルにおいて、組換えＨＡまたはＮＡタンパク質を用いて誘導できることを実証する。]
[0016] これまでの研究では、表面インフルエンザ糖タンパク質、ＨＡおよびＮＡが、インフルエンザウイルスに対する防御免疫の誘発の主要標的であり、Ｍ１がインフルエンザに対する細胞性免疫の保存標的を供給することが示されているため、新しいワクチン候補は、これらのウイルス抗原を、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのタンパク質巨大分子粒子として含んでいてもよい。ワクチン製品として、ＶＬＰには、サブユニットまたは組換え抗原よりも免疫原性であるという利点があり、体液性および細胞性免疫反応の両方を刺激することができる（ＧｒｇａｃｉｃおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、２００６年）。さらに、これらのインフルエンザ抗原を有する粒子は、インフルエンザウイルスの複数の菌株に対する中和抗体を誘発する立体構造エピトープを提示していてもよい。]
[0017] ワクチン目的用の非感染性インフルエンザウイルス菌株の生産は、偶発的な感染を回避する１つの方法である。あるいは、培養ウイルスの代替としてウイルス様粒子（ＶＬＰ）が研究されている。ＶＬＰは、ウイルスカプシドの構造を模倣するが、ゲノムを欠いており、したがって複製することができないか、または二次感染のための手段を準備することができない。]
[0018] いくつかの研究により、組換えインフルエンザタンパク質は、哺乳動物発現プラスミドまたはバキュロウイルスベクターを使用して、細胞培養中でＶＬＰへと自己組織化することが実証されている（Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓら、１９９９年；Ｎｅｕｍａｎｎら、２０００年；ＬａｔｈａｍおよびＧａｌａｒｚａ、２００１年）。Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓら（１９９９年）では、インフルエンザＶＬＰの効率的な形成が、いくつかのウイルスタンパク質の発現レベルに依存することが開示されている。Ｎｅｕｍａｎｎら（２０００年）では、クローニングされたｃＤＮＡのみに由来する伝染性インフルエンザウイルス様粒子を生成するための哺乳動物発現プラスミドに基づく系が確立された。ＬａｔｈａｍおよびＧａｌａｒｚａ（２００１年）では、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、およびＭ２遺伝子を共発現する組換えバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞におけるインフルエンザＶＬＰの形成が報告されている。これらの研究により、インフルエンザビリオンタンパク質は、真核細胞中で共発現されると自己組織化することが実証された。]
[0019] Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓら（２０００年）では、赤血球凝集素（ＨＡ）に加えて、インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）が、昆虫細胞からのＶＬＰ出芽に不可欠であることが教示されている。しかしながら、Ｃｈｅｎら（２００７年）では、Ｍ１がＶＬＰ形成に必要ではない可能性が教示されており、Ｍ１およびＶＬＰの効率的な放出には、ＨＡの存在およびＮＡにより提供されるシアリダーゼ活性の存在が必要であることが観察されている。ＮＡは、ＶＬＰを産生する細胞の表面にある糖タンパク質のシアル酸を切断し、培地中にＶＬＰを放出する。]
[0020] Ｑｕａｎら２００７年では、バキュロウイルス発現系（昆虫細胞）で生産されたＶＬＰワクチンが、インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１））のいくつかの菌株に対する防御免疫を誘導することが教示されている。Ｑｕａｎにより研究されたＶＬＰは、原形質膜から出芽することが観察され、哺乳動物系（ＭＤＣＫ細胞）で得られたものと類似した、正しいサイズおよび形態であるとみなされた。]
[0021] 特許文献１および特許文献２では、培養中の形質転換ＮＴ−１（タバコ）細胞におけるニューカッスル病ウイルスＨＮまたはトリインフルエンザＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６８（Ｈ５Ｎ９）の発現が教示されている。植物細胞培養で発現されたポリペプチドを含む組成物は、ウサギおよびトリにおいてさまざまな免疫応答を誘発する。]
[0022] エンベロープウイルスは、感染細胞から「出芽する」際に自身の脂質エンベロープを取得し、原形質膜からまたは細胞内小器官の膜から、その膜を取得することができる。インフルエンザウイルス粒子およびＶＬＰは、宿主細胞の原形質膜から出芽する。哺乳動物またはバキュロウイルス細胞系では、例えば、インフルエンザは原形質膜から出芽する（Ｑｕａｎら、２００７年）。ほんの少数のエンベロープウイルスしか植物に感染しないことが公知である（例えば、トポウイルス（Ｔｏｐｏｖｉｒｕｓ）およびラブドウイルスのメンバー）。公知の植物エンベロープウイルスのうち、それらは、原形質膜からではなく宿主細胞の細胞内膜から出芽することを特徴とする。少数の組換えＶＬＰが植物宿主で生産されているが、いずれも原形質膜由来ではなく、インフルエンザＶＬＰを含む原形質膜由来ＶＬＰを植物中で生産することができるかどうかという問題を提起する。]
[0023] 現行のインフルエンザＶＬＰ生産技術は、複数のウイルスタンパク質の共発現に依存しており、大流行および毎年の流行の場合ワクチン接種には対応時間が重要であるため、この依存性はこれらの技術の欠点を表している。ワクチン開発を加速させるためには、より単純なＶＬＰ生産系、例えば非構造性ウイルスタンパク質の発現を必要とせず、１つまたは少数のウイルスタンパク質だけの発現に依存するものが望ましい。]
[0024] 世界中の人々をインフルエンザから防御し将来の大流行を回避するために、ワクチン製造業者は、ワクチン用量を生産するための効率的で迅速な方法を開発する必要があるだろう。ワクチンを生産するために現在行われている受精卵の使用は、不十分であり、長い工程が伴う。]
先行技術

[0025] 国際公開第２００４／０９８５３０号
国際公開第２００４／０９８５３３号]
発明が解決しようとする課題

[0026] 本発明の目的は、改良されたインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供することである。]
課題を解決するための手段

[0027] 本発明によると、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスに由来する抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。抗原はインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）であってもよい。]
[0028] ＨＡは、天然または非天然シグナルペプチドを含んでいてもよく、非天然シグナルペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドであってもよい。]
[0029] 核酸によってコードされるＨＡは、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザであってもよく、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザの亜型である。本発明のいくつかの態様では、核酸によってコードされるＨＡは、Ａ型インフルエンザ由来であってもよく、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されてもよい。]
[0030] 本発明は、インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法であって、
ａ）植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスに由来する抗原、例えばインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードする核酸を植物またはその部分に導入するステップと、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で植物またはその部分をインキュベートし、それによりＶＬＰを生産するステップと
を含む方法も提供する。]
[0031] この方法は、植物を回収し、植物組織からＶＬＰを精製または分離するステップをさらに含んでいてもよい。]
[0032] この方法は、導入ステップ（ステップａ）において、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含んでいてもよい。]
[0033] １つまたは複数のシャペロンタンパク質は、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０を含む群から選択されてもよい。]
[0034] 本発明は、導入ステップ（ステップａ）において、核酸が植物中で一過性に発現されるか、または植物中で安定的に発現されるかのいずれかであってもよい上記の方法を含む。さらに、ＶＬＰは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。]
[0035] 本発明の別の態様によると、インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法であって、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルス由来の抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物または植物の部分を準備するステップと、核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の部分をインキュベートし、それによりＶＬＰを生産するステップとを含む方法が提供される。]
[0036] この方法は、植物を回収し、植物組織からＶＬＰを精製または分離するステップをさらに含んでいてもよい。]
[0037] 本発明は、準備ステップの後で、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入し、植物または植物の部分を、核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートし、それによりＶＬＰを生産する上記の方法を含む。]
[0038] １つまたは複数のシャペロンタンパク質は、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０を含む群から選択されてもよい。]
[0039] 本発明は、導入ステップ（ステップａ）において、ＨＡをコードする核酸が、植物中で安定的に発現される上記の方法を含む。さらに、ＶＬＰは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。]
[0040] 本発明は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質および植物に由来する１つまたは複数の脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）も提供する。]
[0041] ＶＬＰのＨＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ由来であってもよく、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡの亜型である。本発明のいくつかの態様では、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である。]
[0042] 本発明には、有効用量のＶＬＰを含む組成物であって、ＶＬＰがインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質、および薬学的に許容される担体を含む組成物も含まれる。]
[0043] 本発明は、植物においてＶＬＰを形成するＨＡタンパク質の断片または部分も企図する。]
[0044] 本発明は、植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾Ｎ−グリカンを保持するインフルエンザウイルスＨＡを含むＶＬＰにも関する。ＶＬＰのＨＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ由来であってもよく、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡの亜型である。本発明のいくつかの態様では、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である。]
[0045] ＶＬＰは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６またはそれらの断片もしくは部分を含む１つまたは複数の亜型のＨＡタンパク質を含んでいてもよい。そのようなＨＡタンパク質を含む亜型の例には、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１９９５、Ａ／ｈｅｒｒｉｎｇ ｇｕｌｌ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３２／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＭＮ／３３／００、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２０００、Ａ／ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｐｉｎｔａｉｌ／ＴＸ／８２８１８９／０２、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｓｈｏｖｅｌｅｒ／Ｉｒａｎ／Ｇ５４／０３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／Ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、Ｃ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／６６、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））が含まれる。]
[0046] 本発明のある態様では、ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、またはＨ９亜型であってもよい。別の態様では、Ｈ１タンパク質は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、またはＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）菌株由来であってもよい。また、Ｈ３タンパク質は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）またはＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）菌株由来であってもよい。本発明のさらなる態様では、Ｈ２タンパク質は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）菌株由来であってもよい。Ｈ５タンパク質は、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５菌株由来であってもよい。本発明のある態様では、Ｈ６タンパク質は、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）菌株由来であってもよい。Ｈ７タンパク質は、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）菌株由来であってもよい。本発明のある態様では、Ｈ９タンパク質は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）菌株由来である。本発明のさらなる態様では、ＨＡタンパク質はインフルエンザウイルス由来であってもよく、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を含むＢ型ウイルス由来であってもよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、またはＢ亜型に由来するＨＡタンパク質のアミノ酸配列の例には、配列番号４８〜５９が含まれる。]
[0047] インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａであってもよい。]
[0048] 本発明は、ＨＡタンパク質をコードする配列を含む核酸分子も提供する。核酸分子は、ＨＡタンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたは複数の調節領域をさらに含んでいてもよい。核酸分子は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｂ、またはＣをコードする配列を含んでいてもよい。本発明の別の態様では、核酸分子によってコードされるＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、またはＢ亜型であってもよい。核酸分子によってコードされるＨ１タンパク質は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、またはＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）菌株由来である。本発明の別の態様では、核酸分子によってコードされるＨ３タンパク質は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、またはＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）菌株由来であってもよい。本発明のさらなる態様では、核酸分子によってコードされるＨ２タンパク質は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）菌株由来であってもよい。また、核酸分子によってコードされるＨ５タンパク質は、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５菌株由来であってもよい。本発明のある態様では、核酸分子によってコードされるＨ６タンパク質は、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）菌株由来であってもよい。また、核酸分子によってコードされるＨ７タンパク質は、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）菌株由来であってもよい。加えて、核酸分子によってコードされるＨ９タンパク質は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）菌株由来であってもよい。核酸によってコードされるＢ亜型に由来するＨＡタンパク質は、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６またはＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４菌株由来であってもよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、またはＢ亜型に由来するそのようなＨＡタンパク質をコードする核酸分子の配列の例には、配列番号３６〜４７および６０〜７３が含まれる。]
[0049] 核酸配列は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａをコードしていてもよい。]
[0050] ＨＡタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されていてもよい調節領域には、植物細胞、昆虫細胞、または酵母細胞において作動可能であるものが含まれる。そのような調節領域には、プラストシアニン調節領域、リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）の調節領域、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）、ＳＴ−ＬＳ１、ポリヘドリン調節領域、またはｇｐ６４調節領域が含まれていてもよい。他の調節領域には、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはターミネーター配列が含まれる。プラストシアニン調節領域は、アルファルファプラストシアニン調節領域を含んでいてもよく、また５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはターミネーター配列は、アルファルファ配列であってもよい。]
[0051] 対象においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質、および薬学的に許容される担体を含むウイルス様粒子を投与することを含む方法も提供される。ウイルス様粒子は、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下で、対象に投与されてもよい。]
[0052] 本発明は、インフルエンザ、麻疹、エボラ、マールブルク、およびＨＩＶからなる群から選択されるウイルスに由来する１つまたは複数のタンパク質と、非シアル酸付加宿主産生細胞に由来する１つまたは複数の脂質とを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）にも関する。ＨＩＶタンパク質はｐ２４、ｇｐ１２０、またはｇｐ４１であってもよく、エボラウイルスタンパク質はＶＰ３０またはＶＰ３５であってもよく、マールブルグウイルスタンパク質はＧｐ／ＳＧＰであってもよく、麻疹ウイルスタンパク質はＨタンパク質またはＦタンパク質であってもよい。]
[0053] 加えて、本発明は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の宿主脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。例えば、宿主が昆虫の場合、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の昆虫脂質を含んでいてもよく、または宿主が酵母の場合、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の酵母脂質を含んでいてもよい。]
[0054] 本発明は、２つ以上のインフルエンザ菌株または亜型のＶＬＰを含む組成物にも関する。２つ以上の亜型または菌株は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１９９５、Ａ／ｈｅｒｒｉｎｇ ｇｕｌｌ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３２／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＭＮ／３３／００、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２０００、Ａ／ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｐｉｎｔａｉｌ／ＴＸ／８２８１８９／０２、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｓｈｏｖｅｌｅｒ／Ｉｒａｎ／Ｇ５４／０３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／Ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、Ｃ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／６６、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、またはＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））からなる群から選択されてもよい。ＶＬＰの２つ以上の亜型または菌株は、およそ等しい量で存在していてもよく、あるいは亜型または菌株の１つまたは複数は、代表的な菌株または亜型の大部分であってもよい。]
[0055] 本発明は、動物または標的生物においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導するための方法であって、１つまたは複数のＶＬＰを含む有効用量のワクチンを投与することを含み、ＶＬＰが、非シアル酸付加宿主、例えば寄主植物、昆虫宿主、または酵母宿主を使用して生産される方法に関する。ワクチンは、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下に投与されてもよい。標的生物は、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、鳥（トリ）、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、犬（ｄｏｇ）、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）、猫（ｃａｔ）、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ムナジロテン、フェレット、ハウスペット、家畜、マウス、ラット、アシカ、クジラなどを含む群から選択されてもよい。]
[0056] 本発明は、ＶＬＰを生産可能な好適な宿主、例えば植物、昆虫、酵母において、異なるインフルエンザ菌株に由来する赤血球凝集素（ＨＡ）を含有するＶＬＰを生産するための方法を提供する。植物中で生産されるＶＬＰは、植物に由来する脂質を含有し、昆虫細胞中で生産されるＶＬＰは、昆虫細胞の原形質膜に由来する脂質（一般的に「昆虫脂質」と呼ばれる）を含み、酵母中で生産されるＶＬＰは、酵母細胞の原形質膜に由来する脂質（一般的に「酵母脂質」と呼ばれる）を含む。]
[0057] 本発明は、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスに由来する抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、植物、植物組織または植物細胞にも関する。抗原は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）であってもよい。]
[0058] 植物は、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、１つまたは複数シャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含んでいてもよい。１つまたは複数のシャペロンタンパク質は、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０を含む群から選択されてもよい。]
[0059] 植物中でのＶＬＰの生産は、昆虫細胞培養中のこれらの粒子の生産に対していくつかの利点を示す。植物脂質は特異的に免疫細胞を刺激し、誘導された免疫応答を増強することができる。植物膜は、脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）から作られており、植物およびいくつかの細菌および原生動物に特有のスフィンゴ糖脂質も含有する。スフィンゴ脂質は、それらが、グリセロール様ＰＣまたはＰＥのエステルではないが、１８個を超える炭素を含有する脂肪酸鎖にアミド結合を形成する長鎖アミノアルコールからなるという点で珍しい。ＰＣおよびＰＥならびにスフィンゴ糖脂質は、樹状細胞ならびにマクロファージならびに胸腺および肝臓のＢおよびＴリンパ球を含む他の細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの哺乳動物免疫細胞により発現されるＣＤ１分子と結合することができる（Ｔｓｕｊｉ Ｍ，． ２００６年）。さらに、植物脂質の存在の潜在的アジュバント効果に加えて、抗原提示細胞による糖タンパク質抗原の捕捉を容易にする植物Ｎ−グリカンの能力は、植物中でのＶＬＰ生産にとって有利である場合がある（Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ−Ｄｕｐａｓ、２００７年）。]
[0060] 理論により束縛されることは望まないが、植物で作られたＶＬＰは、他の生産系で作製されたＶＬＰより強力な免疫反応を誘導し、生ウイルスワクチンまたは弱毒化全ウイルスワクチンによって誘導された免疫反応と比較して、これらの植物性ＶＬＰによって誘導された免疫反応は、より強力であるだろうと予期される。]
[0061] 全ウイルスから作製されたワクチンとは反対に、ＶＬＰは非感染性であるため利点を提供し、したがって制限的な生物学的封じ込めは、伝染性の全ウイルスと共に作業する場合ほど重要な問題ではなく、生産には必要とされていない。植物で作られたＶＬＰは、温室または畑で発現系を成長させることが可能になることにより、またさらなる利点を提供し、したがって著しくより経済的であり、スケールアップするのにより好適である。]
[0062] 加えて、植物は、シアル酸残基の合成およびタンパク質へのシアル酸残基の付加に関与する酵素を含まない。ＶＬＰはノイラミニダーゼ（ＮＡ）の非存在下で生産することができ、植物中でのＶＬＰ生産を保証するために、ＮＡを共発現する必要はなく、または生産細胞をシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）で処理するかもしくは抽出する必要はない。]
[0063] 本発明により生産されるＶＬＰは、ＲＮＡに結合することが公知であるＭ１タンパク質を含まない。ＲＮＡはＶＬＰ調製の不純物であり、ＶＬＰ生産の規制認可を取得する際に好ましくない。]
[0064] この発明の概要には、本発明の特徴が必ずしもすべて記述されているわけではない。]
[0065] 本発明のこれらおよび他の特徴は、添付図面を参照して次の記載からより明らかになる。]
図面の簡単な説明

[0066] 図１Ａは、本発明の実施形態により、株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）からのＨ１の発現に使用されるアルファルファプラストシアニンに基づく発現カセットの配列を示す図である（配列番号８）。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）シグナルペプチドは下線付きである。クローニングに使用されたＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＳａｃＩ（ＧＡＧＣＴＣ）制限酵素部位が太字で示されている。
図１Ｂは、インフルエンザ赤血球凝集素の機能ドメインの概略図を示す。ＨＡ０、ＨＡ１およびＨＡ２の切断後、断片はジスルフィド架橋により依然として結合されている。
図２Ａは、株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）からＨＡ亜型Ｈ１を発現させるために構築されたプラスミド５４０の表示を示す図である。
図２Ｂは、株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）からＨＡ亜型Ｈ５を発現させるために構築されたプラスミド６６０の表示を示す。
図３は、赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を生産する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。図３Ａは、ブルーデキストラン２０００（三角形）およびタンパク質（菱形）の溶出プロファイルを示す。
図３は、赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を生産する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。図３Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ５００ＨＲビーズ）後のＨ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））溶出画分の免疫検出（ウェスタンブロット；抗Ｈ１）を示す。
図３は、赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を生産する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。図３Ｃは、Ｈ５の溶出プロファイルを示す；ブルーデキストラン２０００（三角形）およびタンパク質（菱形）。
図３は、赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を生産する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。図３Ｄは、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ５００ＨＲビーズ）後のＨ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））溶出画分の免疫検出（ウェスタンブロット；抗Ｈ５）を示す。
図４Ａは、Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＮ末端断片をコードする配列（配列番号１）を示す図である。図４Ｂは、Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＣ末端断片をコードする配列（配列番号２）を示す。
図５は、Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＨＡ０をコードする完全配列（配列番号２８）を示す図である。
図６は、最初のＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位、およびストップ（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位に隣接されたＨ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をコードする配列（配列番号３）を示す図である。
図７Ａは、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃの配列（配列番号４）を示す図である。図７Ｂは、プライマーＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｐｌａｓｔｏ．ｒの配列（配列番号５）を示す図である。図７Ｃは、プライマー Ｐｌａｓｔｏ−ＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）．ｃの配列（配列番号６）を示す図である。図７Ｄは、プライマーＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒの配列（配列番号７）を示す図である。
図８Ａは、Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））ペプチド配列のアミノ酸配列（配列番号９）を示す図である。図８Ｂは、Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））ペプチド配列のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。天然シグナルペプチドが太字で示されている。
図９Ａは、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ７のヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す図である。
図１０Ａは、Ａ型インフルエンザＨＡ、亜型Ｈ２のヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す図である。
図１０Ｂは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ３のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。
図１０Ｃは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ４のヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
図１０Ｄは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ５のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
図１０Ｅは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ６のヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す。
図１０Ｆは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ８のヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。
図１０Ｇは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ９のヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
図１０Ｈは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１０のヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す。
図１０Ｉは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１１のヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す。
図１０Ｊは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１２のヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。
図１０Ｋは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１３のヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。
図１０Ｌは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１４のヌクレオチド配列（配列番号２３）を示す。
図１０Ｍは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１５のヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す。
図１０Ｎは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１６のヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す。
図１０Ｏは、Ｂ型インフルエンザＨＡのヌクレオチド配列（配列番号２６）を示す。
図１０Ｐは、Ｃ型インフルエンザＨＡのヌクレオチド配列（配列番号２７）を示す。
図１０Ｑは、プライマーＸｍａＩ−ｐＰｌａｓ．ｃのヌクレオチド配列（配列番号２９）を示す。
図１０Ｒは、プライマーＳａｃＩ−ＡＴＧ−ｐＰｌａｓ．ｒのヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。
図１０Ｓは、プライマーＳａｃＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｃヌクレオチド配列（配列番号３１）を示す。
図１０Ｔは、プライマーＥｃｏＲＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｒのヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す。
図１１は、本明細書で使用されるようないくつかの構築物の概略図を示す図である。構築物６６０は、プラストシアニンプロモーター（Ｐｌａｓｔｏ）およびターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結されたＨＡ亜型Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をコードするヌクレオチド配列を含み；構築物５４０は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＳＰ ＰＤＩ）と結合してＨＡ亜型Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））をコードするヌクレオチド配列を含み、ならびにプラストシアニンプロモーター（Ｐｌａｓｔｏ）およびターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結され；ＨＡ亜型Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））を発現させるために構築された構築物５４４、Ｈ１をコードするヌクレオチド配列がアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＳＰ ＰＤＩ）およびＧＣＮ４ｐＩＩロイシンジッパー（Ｈ１の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部の代わりに）と結合され、ならびにプラストシアニンプロモーター（Ｐｌａｓｔｏ）およびターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結され；ならびにＡ型インフルエンザ／ＰＲ／８／３４に由来する領域をコードするＭ１を発現させるための構築物７５０は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲと結合され、ならび二重の３５ＳプロモーターおよびＮｏｓターミネーターに作動可能に連結される。
図１２は、構築物６６０で形質転換されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉からのタンパク質抽出物における、抗Ｈ５（Ｖｉｅｔｎａｍ）抗体を用いた、Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））の免疫検出を示す図である（レーン３）。Ａ型インフルエンザ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４に由来する市販のＨ５が検出の陽性対照として使用され（レーン１）、および空ベクターで形質転換された葉からのタンパク質抽出物が陰性対照として使用された（レーン２）。
図１３は、サイズ排除クロマトグラフィーによる赤血球凝集素構造の特徴を示す図である。Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））を生産する別個のバイオマスからのタンパク質抽出物、Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））、可溶性Ｈ１、またはＨ１およびＭ１がＳ−５００ＨＲでのゲル濾過により分離された。ロゼット形態での市販のＨ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））も分画された（Ｈ１ロゼット）。図１３Ａは、相対タンパク質含量について分析された溶出画分を示す（相対タンパク質レベル−バイオマス分画の標準タンパク質溶出プロファイルが示されている）。ブルーデキストラン２０００（２ＭＤ参照基準）溶出ピークが示されている。図１３Ｂは、抗Ｈ５（Ｖｉｅｔｎａｍ）抗体（Ｈ５に対する）で免疫ブロットして赤血球凝集素の存在について分析された溶出画分を示す。図１３Ｃは、Ｈ１に対する抗Ａ型インフルエンザ抗体について分析された溶出画分を示す。図１３Ｄは、可溶性Ｈ１に対する抗Ａ型インフルエンザ抗体について分析された溶出画分を示す。図１３Ｅは、Ｈ１ロゼットに対する抗Ａ型インフルエンザ抗体について分析された溶出画分を示す。図１３Ｆは、Ｈ１＋Ｍ１に対する抗Ａ型インフルエンザ抗体について分析された溶出画分を示す。
図１４は、ショ糖勾配遠心分離によるインフルエンザＨ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））構造の濃度および血球凝集素濃縮画分の電子顕微鏡検査を示す図である。図１４Ａは、ショ糖密度勾配遠心分離からの画分の特徴を示す。各画分は、抗Ｈ５（Ｖｉｅｔｎａｍ）抗体を用いた免疫ブロットによりＨ５の存在（上のパネル）、ならびにこの相対タンパク質含量および赤血球凝集能力（グラフ）について分析された。図１４Ｂは、ショ糖勾配遠心分離からプールされた画分１７、１８および１９のネガティブ染色透過電子顕微鏡検査を示す。バーは１００ｎｍを表す。
図１５は、インフルエンザＨ５ ＶＬＰの精製を示す図である。図１５Ａは、清澄化ステップ−レーン１、粗抽出；レーン２、ｐＨ６調整抽出；レーン３、加熱処理抽出；レーン４、ＤＥ濾過抽出；フェチュインアフィニティー精製ステップ：レーン５、添加；レーン６、フロースルー；レーン７、溶出（１０倍に濃縮）における、タンパク質含量のクマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１５Ｂは、精製されたＨ５ ＶＬＰ試料のネガティブ染色透過電子顕微鏡検査を示す。バーは１００ｎｍを表す。図１５Ｃは、構造の細部を示すために拡大された分離されたＨ５ ＶＬＰを示す。図１５Ｄは、株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）に由来するＨＡに対して産生されたウサギポリクローナル抗体を用いた、クマシー染色された還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーンＡ）およびウェスタンブロット（レーンＢ）におけるＨ５ ＶＬＰ産物を示す。
図１６は、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子のヌクレオチド配列、完全ｃｄｓ．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２８９９２９（配列番号３３）を示す図である。
図１７は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼのためのＭｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ１１４９９（配列番号３４）。
図１８は、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））断片７のヌクレオチド配列、完全配列を示す図である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０１６．１（配列番号３５）。
図１９は、Ｈ５産生組織のポジティブ染色透過電子顕微鏡観察によるＶＬＰ蓄積の局在化を示す図である。ＣＷ：細胞壁、ｃｈ：葉緑体、ｐｍ：原形質膜、ＶＬＰ：ウイルス様粒子。バーは１００ｎｍを表す。
図２０は、植物で作られたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加免疫１４日後の血清抗体反応の誘発を示す図である。図２０（Ａ）筋肉内注射により免疫化されたマウスの抗体反応。図２０（Ｂ）鼻腔内投与により免疫化されたマウスの抗体反応。抗体反応は、不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルスに対し測定された（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５）。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表す。＊組換え可溶性Ｈ５と比較したｐ＜０．０５。
図２１は、植物で作られたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加免疫１４日後の赤血球凝集阻害抗体反応（ＨＡＩ）を示す図である。図２１（Ａ）筋肉内注射により免疫化されたマウスの抗体反応。図２１（Ｂ）鼻腔内投与により免疫化されたマウスの抗体反応。ＨＡＩ抗体反応は、不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルスに対し測定された（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５）。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表す。＊組換え可溶性Ｈ５と比較したｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
図２２は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＶＬＰの免疫原性に対するアジュバント効果を示す図である。図２２（Ａ）筋肉内注射により免疫化されたマウスに対するミョウバンの効果。図２２（Ｂ）鼻腔内投与により免疫化されたマウスに対するキトサンの効果。ＨＡＩ抗体反応は、不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルス（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５）を用いて測定された。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表す。＊対応する組換え可溶性Ｈ５と比較したｐ＜０．０５。
図２３は、Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））投与に対する抗体反応を示す図である。図２３（Ａ）追加免疫３０日後の、筋肉内投与により免疫化されたマウスにおける抗Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５免疫グロブリンアイソタイプ。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｏｇ２）である。ＥＬＩＳＡは、コーティング剤として全不活化Ｈ５Ｎ１（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５）ウイルスを用いて行った。バーは平均偏差を表す。＊対応する組換え可溶性Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））と比較したｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図２３（Ｂ）全不活化ウイルス（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）および（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１））に対する抗体力価。全群が陰性対照とは統計的に異なっている。
図２４は、Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスからの、初回投与１４日週後（２週目）、追加免疫１４日後（５週目）または追加免疫３０日後（７週目）の、相同な全不活化ウイルス（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５）に対する抗体力価を示す図である。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｎ）である。＊組換え可溶性Ｈ５と比較したｐ＜０．０５。
図２５は、追加免疫３０日後の、Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスからの血清抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ交差反応性を示す図である。（Ａ）全不活化ウイルスに対する抗体力価。（Ｂ）さまざまな全不活化ウイルスに対する赤血球凝集阻害力価。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表す。全群が陰性対照とは統計的に異なっている。＊対応する組換え可溶性Ｈ５と比較したｐ＜０．０５。１０未満の値はすべて、任意の値５（ｌｎに対して１．６）が与えられ、陰性とみなされる。
図２６は、植物で作られたＨ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））の有効性を示す図である。（Ａ）インフルエンザ株Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／５８２／０６（Ｈ５Ｎ１）の１０００ ＬＤ５０（４．０９×１０６ ＣＣＩＤ５０）による免疫誘発後のマウスの生存率。（Ｂ）免疫誘発後の免疫化マウスの体重。値は生存マウスの平均体重である。
図２７は、植物に由来するインフルエンザＶＬＰの由来を示す図である。（Ａ）精製インフルエンザＶＬＰの極性脂質組成物。タンパク質４０μｇ当量に含有された脂質が、記載の通りＶＬＰから抽出され、ＨＰ−ＴＬＣにより分離され、および高度に精製されたタバコ原形質膜（ＰＭ）から単離された脂質の移動プロファイルと比較された。脂質の略号は以下の通りである：ＤＧＤＧ、ジガラクトシルジアシルグリセロール；ｇｌｕＣＥＲ、グルコシル−セラミド；ＰＡ、リン酸；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン；ＰＧ、ホスファチジルグリセロール；ＰＩ、ホスファチジルイノシトール；ＰＳ、ホスファチジルセリン；ＳＧ、ステリル−グリコシド。（Ｂ）精製インフルエンザＶＬＰの中性脂質組成物。タンパク質２０μｇ当量に含有された脂質が、記載の通りＶＬＰから抽出され、ＨＰ−ＴＬＣにより分離され、およびシトステロールの移動と比較された。（Ｃ）精製ＶＬＰおよびタバコ葉に由来する高度に精製されたＰＭ（ＰＭＬ）およびＢＹ２タバコ細胞（ＰＭＢＹ２）における原形質膜マーカープロトンポンプＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）の免疫検出。１８マイクログラムのタンパク質が各レーンに添加された。
図２８は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）のクローン７７４ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号３６）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図２９は、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）のクローン７７５ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号３７）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図３０は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）のクローン７７６ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号３８）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図３１は、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）のクローン７７７ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号３９）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図３２は、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４のクローン７７８ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４０）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図３３は、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６のクローン７７９ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４１）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図３４は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）のクローン７８０ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４２）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図３５は、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）のクローン７８１ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４３）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図３６は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）のクローン７８２ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４４）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図３７は、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）のクローン７８３ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４５）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図３８は、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）のクローン７８４ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４６）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図３９は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のクローン７８５ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４７）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。
図４０Ａは、クローン７７４（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４８）を示す図である。クローン７７４のオープンリーディングフレームは、図２８に示されたＡＴＧから開始する。図４０Ｂは、クローン７７５（Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６（Ｈ１Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４９）を示す。クローン７７５のオープンリーディングフレームは、図２９に示されたＡＴＧから開始する。
図４１Ａは、クローン７７６（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５０）を示す図である。クローン７７６のオープンリーディングフレームは、図３０に示されたＡＴＧから開始する。図４１Ｂは、クローン７７７（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５１）を示す。クローン７７７のオープンリーディングフレームは、図３１に示されたＡＴＧから開始する。
図４２Ａは、クローン７７８（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４）から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５２）を示す図である。クローン７７８のオープンリーディングフレームは、図３２に示されたＡＴＧから開始する。図４２Ｂは、クローン７７９（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６）から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５３）を示す。クローン７７９のオープンリーディングフレームは、図３３に示されたＡＴＧから開始する。
図４３Ａは、クローン７８０（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５４）を示す図である。クローン７８０のオープンリーディングフレームは、図３４に示されたＡＴＧから開始する。図４３Ｂは、クローン７８１（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５５）を示す。クローン７８１のオープンリーディングフレームは、図３５に示されたＡＴＧから開始する。
図４４Ａは、クローン７８２（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５６）を示す図である。クローン７８２のオープンリーディングフレームは、図３６に示されたＡＴＧから開始する。図４４Ｂは、クローン７８３（Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５７）を示す。クローン７８３のオープンリーディングフレームは、図３７に示されたＡＴＧから開始する。
図４５Ａは、クローン７８４（Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５８）を示す図である。クローン７８４のオープンリーディングフレームは、図３８に示されたＡＴＧから開始する。図４５Ｂは、クローン７８５（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５９）を示す。クローン７８５のオープンリーディングフレームは、図３９に示されたＡＴＧから開始する。
図４６は、サイズ排除クロマトグラフィー後の、植物で生産されたＶＬＰ溶出画分７〜１７の免疫検出（ウェスタンブロット）を示す図である。ブルーデキストランの溶出ピーク（画分１０）が矢印で示されている。赤血球凝集素亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６およびＨ９が示される。赤血球凝集素はＶＬＰ溶出に対応する画分７〜１４で検出される。
図４７は、毎年の流行株に由来する赤血球凝集素シリーズの発現の免疫ブロット分析を示す図である。さまざまなインフルエンザ株（免疫ブロットの一番上に示されている）に由来するＨＡを発現する植物に対し、１０および２０マイクログラムの葉タンパク質抽出物が、それぞれレーン１および２に添加された。
図４８Ａは、潜在的パンデミック株に由来するＨ５赤血球凝集素シリーズの発現の免疫ブロット分析を示す図である。１０および２０マイクログラムのタンパク質抽出物が、それぞれレーン１および２に添加された。図４８Ｂは、選択されたインフルエンザ株に由来するＨ２、Ｈ７およびＨ９赤血球凝集素の発現の免疫ブロット分析を示す。１０および２０マイクログラムのタンパク質抽出物が、それぞれレーン１および２に添加された。
図４９は、ＡＧＬ１／６６０でアグロインフィルトレーションされた、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ葉からのタンパク質抽出物における株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５の免疫ブロットを示す図である。２つの植物植物（植物１および植物２）がインフィルトレーションされ、各植物から抽出された１０および２０μｇの可溶性タンパク質が、それぞれレーン１および２に添加された。
図５０は、血清抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ交差反応性を示す図である。（Ａ）最初の免疫化１４日後および（Ｂ）植物で作られたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））による２回目の追加免疫１４日後の、フェレット血清における赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価。ＨＡＩ抗体反応は、次の不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルス：Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ａ／Ａｎｈｕｉ／５／０５および相同株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５を用いて測定された。値は、１群当たり５匹のフェレットの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｏｇ２）である。斜線−Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／６／０６（クレード２．１．３）；格子縞−Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（クレード２．２）；白いバー−Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（クレード１）；黒いバー−Ａ／Ａｎｈｕｉ／５／０５。レスポンダーが示されている。バーは平均偏差を表す。
図５１は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５（構築物＃６６０）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６０）を示す図である。
図５２は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９に由来するＨ１（構築物＃５４０）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６１）を示す図である。
図５３は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１（構築物＃７７４）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６２）を示す図である。
図５４は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）に由来するＨ１（構築物＃７７５）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６３）を示す図である。
図５５は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）に由来するＨ２（構築物＃７８０）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６４）を示す図である。
図５６は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）に由来するＨ５（構築物＃７８１）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６５）を示す図である。
図５７は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）に由来するＨ５（構築物＃７８２）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６６）を示す図である。
図５８は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）に由来するＨ６（構築物＃７８３）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６７）を示す図である。
図５９は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）に由来するＨ９（構築物＃７８５）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６８）を示す図である。
図６０は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）に由来するＨ３の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６９）を示す図である。
図６１は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）に由来するＨ３の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号７０）を示す図である。
図６２は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）に由来するＨ７の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号７１）を示す図である。
図６３は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４に由来するＨＡの赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号７２）を示す図である。
図６４は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡの赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号７３）を示す図である。
図６５は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号３３によってコードされる）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４８）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４９）および配列番号９のＨＡのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号７４）を示す図である。Ｘ１（３位）はＡまたはＶ；Ｘ２（５２位）はＤまたはＮ；Ｘ３（９０位）はＫまたはＲ；Ｘ４（９９位）はＫまたはＴ；Ｘ５（１１１位）はＹまたはＨ；Ｘ６（１４５位）はＶまたはＴ；Ｘ７（１５４位）はＥまたはＫ；Ｘ８（１６１位）はＲまたはＫ；Ｘ９（１８１位）はＶまたはＡ；Ｘ１０（２０３位）はＤまたはＮ；Ｘ１１（２０５位）はＲまたはＫ；Ｘ１２（２１０位）はＴまたはＫ；Ｘ１３（２２５位）はＲまたはＫ；Ｘ１４（２６８位）はＷまたはＲ；Ｘ１５（２８３位）はＴまたはＮ；Ｘ１６（２９０位）はＥまたはＫ；Ｘ１７（４３２位）はＩまたはＬ；Ｘ１８（４８９位）はＮまたはＤ。
図６６は、配列番号３３によってコードされるＨ１ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（ＡＡＰ３４３２４．１）のアミノ酸配列（配列番号７５）を示す図である。
図６７は、配列番号３５によってコードされるＨ１ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ（ＮＣ＿０４０９８７８．１）のアミノ酸配列（配列番号７６）を示す図である。
図６８は、ＰａｃＩ（プロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの発現カセット番号８２８の一部の核酸配列を示す図である。ＣＰＭＶＨＴ５’ＵＴＲ配列が、変異したＡＴＧで下線されている。ＡｐａＩ制限酵素認識（このケースＣ５−１カッパ軽鎖では、発現されるタンパク質コード配列のＡＴＧのすぐ上流。）
図６９は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンプロモーターの上流のマルチクローニング部位中）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号６６３の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＨ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来）コード配列は下線付きである。
図７０は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンプロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７８７の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＨ１（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７由来）コード配列は下線付きである。
図７１は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンプロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７９０の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＨ３（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７由来）コード配列は下線付きである。
図７２は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンプロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７９８の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合した、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６由来ＨＡコード配列は下線付きである。
図７３は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号５８０の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＨ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９由来）のコード配列は下線付きである。
図７４は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号６８５の一部の核酸配列を示す図である。Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５のコード配列は下線付きである。
図７５は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号６８６の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５のコード配列は下線付きである。
図７６は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３２の一部の核酸配列を示す図である。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１のコード配列は下線付きである。
図７７は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３３の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１のコード配列は下線付きである。
図７８は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３５の一部の核酸配列を示す図である。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨ３のコード配列は下線付きである。
図７９は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３６の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨ３のコード配列は下線付きである。
図８０は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３８の一部の核酸配列を示す図である。Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡのコード配列は下線付きである。
図８１は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３９の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡのコード配列は下線付きである。
図８２は、Ｍｓｊ１をコードする核酸配列（配列番号１１４）を示す図である。
図８３は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号Ｒ８５０の一部の核酸配列を示す図である。ＨＳＰ４０コード配列は下線付きである。
図８４は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号Ｒ８６０の一部の核酸配列を示す図である。ＨＳＰ７０コード配列は下線付きである。
図８５は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号Ｒ８７０の一部の核酸配列を示す図である。ＨＳＰ４０コード配列の両端に下線されたイタリック体であり、およびＨＳＰ７０コード配列は下線付きである。Ａ）ヌクレオチド１〜５００３；Ｂ）ヌクレオチド５００４〜９４９３。
図８６は、構築物Ｒ４７２の概略図を示す図である。
図８７は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに由来するシグナルペプチドを用いたＨＡの発現の免疫ブロット分析を示す図である。５マイクログラムが使用されたＨ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））を除いて、３つの別個の植物から得られた２０マイクログラムの葉タンパク質抽出物がＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加された。示された対照（相同株の全不活化ウイルス（ＷＩＶ））は、５または２０マイクログラムの疑似インフィルトレーションされた植物においてスパイクされた。ａ）Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９に由来するＨ１の発現、ｂ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１の発現、ｃ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨ３の発現、ｄ）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５の発現、ｅ）Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡの発現。矢印は、ＨＡ０に対応する免疫バンドを示す。ＳＰ ＷＴ：天然シグナルペプチド、ＰＳ ＰＤＩ：アルファルファＰＤＩシグナルペプチド。
図８８は、葉タンパク質抽出物の免疫ブロット分析によるＨＡ発現戦略の比較を示す図である。ＨＡは、プラストシアニン−またはＣＰＭＶ−ＨＴベースのカセットを用いて生産された。ＣＰＭＶ−ＨＴについては、野生型ＨＡシグナルペプチドおよびアルファルファＰＤＩに由来するシグナルペプチドも比較された。分析されたＨＡ亜型については、５マイクログラムのタンパク質が添加されたＨ１ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａを除いて、２０μｇのタンパク質抽出物がＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加された。ａ）Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９に由来するＨ１の発現、ｂ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１の発現、ｃ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨ３の発現、ｄ）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５の発現、およびｅ）Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＢの発現。矢印は、ＨＡ０に対応する免疫バンドを指す；ＨＡ発現に使用される特定のベクターを含む特定のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株がレーンの一番上に示されている。
図８９は、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０と共発現された場合のＨＡ蓄積の免疫ブロットを示す図である。Ｈ１ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（ＡＧＬ１／５４０）およびＨ３ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＡＧＬ１／７９０）は、単独で発現またはＡＧＬ１／Ｒ８７０と共発現された。ＨＡ蓄積レベルは、インフィルトレーションされた葉に由来するタンパク質抽出物の免疫ブロット分析により評価された。株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９またはＢｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７の全不活化ウイルス（ＷＩＶ）が対照として使用された。] 図１０Ａ 図１０Ｂ 図１０Ｃ 図１０Ｄ 図１０Ｅ 図１０Ｆ 図１０Ｇ 図１０Ｈ 図１０Ｉ 図１０Ｊ
[0067] 本発明はウイルス様粒子の生産に関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザ抗原を含むウイルス様粒子の生産に関する。]
[0068] 以下の説明は、好ましい実施形態についてである。]
[0069] 本発明は、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスに由来する抗原、例えばインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。]
[0070] さらに、本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法を提供する。本方法は、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された抗原をコードする核酸を植物または植物の部分に導入すること、および核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の部分をインキュベートし、それによりＶＬＰを生産することに関する。]
[0071] ＶＬＰは、インフルエンザウイルスから生産することできるが、ＶＬＰは、これらに限定されないが、麻疹、エボラ、マールブルク、およびＨＩＶを含む他の原形質膜由来ウイルスから生産することもできる。]
[0072] 本発明は、例えば、これらに限定されないが、以下を含むヒトに感染することができるすべての型のインフルエンザウイルスのＶＬＰを含む：非常に蔓延しているＡ（Ｈ１Ｎ１）亜型（例えばＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）（配列番号６０）、およびそれほど一般的でないＢ型（例えば配列番号２６、図１０Ｏ）、およびＣ型（配列番号２７、図１０Ｐ）、および他のインフルエンザ亜型から取得されるＨＡ。他のインフルエンザ亜型のＶＬＰも本発明に含まれ、例えば、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１；配列番号４８）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１；配列番号４９）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２；配列番号５４）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１；配列番号５５）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１；配列番号５６）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１；配列番号５７）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２；配列番号５９）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２；配列番号５０）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２；配列番号５１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７；配列番号５８）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（配列番号５２）、またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（配列番号５３）である。] 図１０Ｏ 図１０Ｐ
[0073] 本発明は、他の哺乳類または宿主動物、例えばヒト、霊長類、ウマ、ブタ、鳥、トリ、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ、犬、ネコ、猫、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ムナジロテン、フェレット、ハウスペット、家畜、マウス、ラット、アシカ、クジラなどに感染するインフルエンザウイルスにも関する。]
[0074] 原形質膜由来ウイルスで発現することができる他の抗原の非限定的な例には、ＨＩＶのカプシドタンパク質−ｐ２４；ｇｐ１２０、ｇｐ４１−エンベロープタンパク質、構造タンパク質ＶＰ３０およびＶＰ３５；フィロウイルス、例えばエボラまたはマールブルクのＧｐ／ＳＧＰ（グリコシル化内在性膜タンパク質）、またはパラミクソウイルス、例えば麻疹のＨタンパク質およびＦタンパク質が含まれる。]
[0075] 本発明は、これらに限定されないが、ＶＬＰタンパク質が発現される細胞の原形質膜から脂質エンベロープを取得するインフルエンザ由来ＶＬＰも含まれる。例えば、ＶＬＰが植物に基づく系で発現される場合、ＶＬＰは細胞の原形質膜から脂質エンベロープを取得することができる。]
[0076] 一般的に、「脂質」という用語は、脂溶性（親油性）の、天然に存在する分子を指す。この用語は、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリ−、ジ−、およびモノグリセリドならびにリン脂質）、ならびに他の脂溶性ステロール含有代謝産物またはステロールをより具体的に指すためにも使用される。リン脂質は、糖脂質、ステロール、およびタンパク質と共に、あらゆる生体膜の主成分である。リン脂質の例には、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどが含まれる。ステロールの例には、動物ステロール（例えばコレステロール）および植物ステロール（例えばシトステロール）およびステリル−グルコシドが含まれる。２００種を超える植物ステロールが、種々の植物種で同定されており、最も一般的なものは、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラジカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ダウノステロール（ｄａｕｎｏｓｔｅｒｏｌ）、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロール、またはβ−シトステロールである。当業者であれば理解するであろうように、細胞の原形質膜の脂質組成は、細胞または細胞が取得される生物の培養または成長条件に応じて変動する場合がある。]
[0077] 細胞膜は、一般的に、脂質二分子膜ならびに種々の機能を果たすタンパク質を含む。特定の脂質の局所的集中が、脂質二分子膜に見出される場合があり、「脂質ラフト」と呼ばれている。理論により束縛されることは望まないが、脂質ラフトは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の伝染性因子の進入または放出、細胞間シグナル伝達、細胞内および細胞外マトリックスなどの細胞または生物の他の構造構成要素との相互作用に重要な役割を果たしている可能性がある。]
[0078] インフルエンザウイルスに関して、「赤血球凝集素」または「ＨＡ」という用語は、本明細書中で使用される場合、インフルエンザウイルス粒子の外部に見出される糖タンパク質を指す。ＨＡは、一般的に、シグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、およびＣ末端膜の貫通アンカー部位および小型細胞質尾部を含むＨＡ２ドメインを含むホモ三量体膜Ｉ型糖タンパク質である（図１Ｂ）。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は周知および入手可能であり、例えば、両方が参照により本明細書に組み込まれる、生体防御公衆衛生データベース（ＢｉｏＤｅｆｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ｂａｓｅ）（インフルエンザウイルス；ＵＲＬ：ｂｉｏｈｅａｌｔｈｂａｓｅ．ｏｒｇを参照）または国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）を参照されたい。] 図１Ｂ
[0079] 「ホモ三量体」または「ホモ三量体の」という用語は、オリゴマーが、３つのＨＡタンパク質分子によって形成されていることを示す。理論により束縛されることは望まないが、ＨＡタンパク質は、約７５ｋＤａのモノマー前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成され、表面で構築されて細長い三量体タンパク質になる。三量体化が生じる前に、前駆体タンパク質は、保存された活性化切断部位（融合ペプチドとも呼ばれる）で切断されて、ジスルフィド結合により連結された２つのポリペプチド鎖、ＨＡ１およびＨＡ２（膜貫通領域を含む）になる。ＨＡ１セグメントは、長さが３２８アミノ酸であってもよく、ＨＡ２セグメントは長さが２２１アミノ酸であってもよい。この切断は、ウイルス感染性に重要である場合があるが、タンパク質の三量体化には不可欠ではない場合がある。宿主細胞の小胞体（ＥＲ）膜内へのＨＡの挿入、シグナルペプチド切断、およびタンパク質グリコシル化は、共翻訳事象である。ＨＡの正しいリフォールディングには、タンパク質のグリコシル化および６つの鎖内ジスルフィド結合の形成が必要である。ＨＡ三量体は、シスおよびトランスゴルジ複合体内で構築され、膜貫通ドメインは、三量体化プロセスに役割を果たす。膜貫通ドメインを欠くブロメライン処理ＨＡタンパク質の結晶構造は、インフルエンザ菌株の中で高度に保存された構造を示している。ＨＡは感染プロセス中に大きな構造変化を起こし、それは前駆体ＨＡ０が切断されて２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２になるのに必要であることも確立されている。ＨＡタンパク質は、プロセシングされてもよく（つまり、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインを含む）、またはプロセシングされなくともよい（つまり、ＨＡ０ドメインを含む）。]
[0080] 本発明は、膜貫通ドメインを含むＨＡタンパク質の使用に関し、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインを含み、例えば、ＨＡタンパク質はＨＡ０であってもよく、またはＨＡ１およびＨＡ２を含むプロセシングされたＨＡであってもよい。ＨＡタンパク質は、植物または植物細胞発現系を使用するＶＬＰの生産または形成に使用することができる。]
[0081] 本発明のＨＡは、任意の亜型から取得することができる。例えば、ＨＡは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６であってもよく、またはＢ型インフルエンザのものであってもよい。本発明の組換えＨＡは、当技術分野で公知である任意の赤血球凝集素の配列に基づくアミノ酸配列を含むこともできる。例えば、生体防御公衆衛生データベース（インフルエンザウイルス；ＵＲＬ：ｂｉｏｈｅａｌｔｈｂａｓｅ．ｏｒｇを参照）または国立バイオテクノロジー情報センター（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）を参照されたい。さらに、ＨＡは、１つまたは複数の顕現性インフルエンザウイルスまたは新たに同定されたインフルエンザウイルスから単離される赤血球凝集素の配列に基づいていてもよい。]
[0082] 本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ亜型から取得されるＨＡを含むＶＬＰも含む。例えば、ＶＬＰは、以下のものに由来する１つまたは複数のＨＡを含んでいてもよい：亜型Ｈ１（配列番号２８によってコードされる）、Ｈ２（配列番号１２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号１３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号１４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号１５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号１６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号１１によってコードされる）、Ｈ８（配列番号１７によってコードされる）、Ｈ９（配列番号１８によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号１９によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号２０によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号２１によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号２７によってコードされる）、Ｈ１４（配列番号２３によってコードされる）、Ｈ１５（配列番号２４によってコードされる）、Ｈ１６（配列番号２５によってコードされる）、またはＢ型インフルエンザ（配列番号２６によってコードされる）、またはそれらの組合せ。１つまたは複数のインフルエンザ亜型に由来する１つまたは複数のＨＡを、植物または昆虫細胞内で共発現させて、１つまたは複数のＨＡの合成が、１つまたは複数のインフルエンザ亜型から取得されるＨＡの組合せを含むＶＬＰの形成に帰着することを確実にすることができる。ＨＡの組合せの選択は、ＶＬＰから調製されたワクチンの使用目的によって決定されてもよい。例えば、トリへの接種に使用されるワクチンは、ＨＡ亜型の任意の組合せを含んでいてもよく、その一方でヒト接種に有用なＶＬＰは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、およびＮ７のうちの１つまたは複数の亜型を含んでいてもよい。しかしながら、接種材料の使用に依存して、他のＨＡ亜型の組合せが調製されてもよい。]
[0083] したがって、本発明は、１つまたは複数のＨＡ亜型、例えば２、３、４、５または６つ以上のＨＡ亜型を含むＶＬＰに関する。]
[0084] 本発明は、植物で発現された際にＶＬＰを形成する赤血球凝集素をコードする核酸も提供する。]
[0085] 典型的な核酸は、インフルエンザ亜型の選択された菌株に由来する赤血球凝集素のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。例えば、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号３３）などのＡ（Ｈ１Ｎ１）亜型、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）（構築物＃６６０を含む；配列番号６０）、およびそれほど一般的でないＢ型（例えば、配列番号２６、図１０Ｏ）、およびＣ型（配列番号２７、図１０Ｐ）、および他のインフルエンザ亜型から取得されるＨＡ。他のインフルエンザ亜型のＶＬＰも、本発明に含まれ、例えば、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１；配列番号３６）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１；配列番号３７）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２；配列番号４２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１；配列番号４３）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１；配列番号４４）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１；配列番号４５）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２；配列番号４７）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２；配列番号３８）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２；配列番号３９）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７；配列番号４６）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（配列番号４０）、またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（配列番号４１）である。] 図１０Ｏ 図１０Ｐ
[0086] 赤血球凝集素の正しいフォールディングは、インフルエンザ赤血球凝集素の他の特徴の中でも、タンパク質の安定性、多量体の形成、ＶＬＰの形成、およびＨＡの機能（赤血球凝集能力）にとって重要である場合がある。タンパク質のフォールディングは、これらに限定されないが、タンパク質の配列、タンパク質の相対的存在量、細胞内の密集度、フォールディングした、部分的にフォールディングした、もしくはアンフォールディングしたタンパク質に結合もしくは一時的に結合することができる補助因子の利用可能性、または１つもしくは複数のシャペロンタンパク質の存在などの、１つまたは複数の要因により影響を受ける場合がある。]
[0087] ヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ）またはストレスタンパク質は、シャペロンタンパク質の例であり、タンパク質合成、細胞内輸送、ミスフォールディングの防止、タンパク質凝集の防止、タンパク質複合体の構築および分解、タンパク質フォールディング、およびタンパク質脱凝集を含む種々の細胞プロセスに関与している場合がある。そのようなシャペロンタンパク質の例には、これらに限定されないが、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ６５、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ２０〜３０、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ１００〜２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、ＴＦ５５、ＦＫＢＰ、サイクロフィリン、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、ユビキチン、カルネキシン、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼが含まれる。例えば、Ｍａｃａｒｉｏ， Ａ．Ｊ．Ｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓ．２５巻：５９〜７０頁、１９９５年；Ｐａｒｓｅｌｌ， Ｄ．Ａ． ＆ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ， Ｓ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．２７巻：４３７〜４９６頁（１９９３年）；米国特許第５，２３２，８３３号を参照されたい。いくつかの例では、シャペロンタンパク質の特定の群には、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０が含まれる。]
[0088] Ｈｓｐ７０の例には、哺乳動物細胞に由来するＨｓｐ７２およびＨｓｃ７３、細菌、特にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓなどのミコバクテリアに由来するＤｎａＫ（Ｂａｃｉｌｌｅ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎなどの：本明細書中ではＨｓｐ７ｌと呼ぶ）が含まれる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、酵母、および他の原核生物に由来するＤｎａＫ、ならびにＡ．ｔｈａｌｉａｎａなどの真核生物に由来するＢｉＰおよびＧｒｐ７８（Ｌｉｎら、２００１年（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ６巻：２０１〜２０８頁））。Ｈｓｐ７０の特定の例は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ Ｈｓｐ７０（配列番号１２２または配列番号１２３によってコードされる）である。Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰならびにアンフォールディングしたポリペプチドおよびペプチドと特異的に結合可能であり、それによりタンパク質のフォールディングおよびアンフォールディング、ならびにタンパク質複合体の構築および分解に関与する。]
[0089] Ｈｓｐ４０の例には、Ｅ．ｃｏｌｉおよびミコバクテリアなどの原核生物に由来するＤｎａＪ、ならびにアルファルファなどの真核生物に由来するＨＳＪ１、ＨＤＪｌ、およびＨｓｐ４０が含まれる（Ｆｒｕｇｉｓら、１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０巻：３９７〜４０８頁）。Ｈｓｐ４０の特定の例は、Ｍ．ｓａｔｉｖａ ＭｓＪ１（配列番号１２１、１２３、または１１４によってコードされる）である。Ｈｓｐ４０は、分子シャペロンとして、他の細胞活性の中でも、タンパク質のフォールディング、熱耐性、およびＤＮＡ複製に役割を果たす。]
[0090] Ｈｓｐの中でも、Ｈｓｐ７０およびそのコシャペロンＨｓｐ４０は、合成が完了する前の翻訳中である新規合成ポリペプチドの安定化に関与する。理論により束縛されることは望まないが、Ｈｓｐ４０は、アンフォールディングしている（新生、または新たに移動してきた）ポリペプチドの疎水性パッチに結合し、したがってＨｓｐ７０−ＡＴＰ複合体とポリペプチドとの相互作用を容易にする。ＡＴＰの加水分解は、ポリペプチドとＨｓｐ７０とＡＤＰとの間の安定した複合体の形成、およびＨｓｐ４０の放出に結びつく。ポリペプチドの疎水性パッチとＨｓｐ７０−ＡＤＰ複合体が結合すると、他の疎水性パッチとのそれらの相互作用が防止され、正しくないフォールディングおよび他のタンパク質との凝集体の形成が防止される（Ｈａｒｔｌ， ＦＵ．、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ ３８１巻：５７１〜５７９頁）。]
[0091] また、理論により束縛されることは望まないが、組換えタンパク質発現系でのタンパク質産生が増加すると共に、組換えタンパク質発現に対する込み合い効果は、ミスフォールディングしたポリペプチドの凝集および／または分解に起因する組換えタンパク質の蓄積低減に帰着する場合がある。天然シャペロンタンパク質は、低レベルの組換えタンパク質の正しいフォールディングを容易にすることができる場合があるが、発現レベルが増加すると共に、天然シャペロンが限定要因になる場合がある。アグロインフィルトレーションされた（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ）葉中での赤血球凝集素の高レベル発現は、細胞質ゾルの赤血球凝集素ポリペプチドの蓄積に結びつく場合があり、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、またはＨｓｐ７０およびＨｓｐ４０の両方などの１つまたは複数のシャペロンタンパク質の共発現は、ポリペプチド細胞を発現する細胞の細胞質ゾル中での安定性を増加させることができ、したがってミスフォールディングまたは凝集した赤血球凝集素ポリペプチドのレベルを低減させること、およびポリペプチドの数を増加させることにより、赤血球凝集および／またはウイルス様粒子の形成を可能にする三次および四次構造の特徴を示す安定した赤血球凝集素が蓄積する。]
[0092] したがって、本発明は、植物中でインフルエンザＶＬＰを生産する方法であって、インフルエンザＨＡをコードする第１の核酸が、シャペロンをコードする第２の核酸と共発現される方法も提供する。第１および第２の核酸は、同じステップにおいて植物に導入されてもよく、または順次植物に導入されてもよい。本発明は、植物中でインフルエンザＶＬＰを生産する方法であって、植物が第１の核酸を含み、第２の核酸がその後導入される方法も提供する。]
[0093] 本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ赤血球凝集素をコードする核酸および１つまたは複数のシャペロンをコードする核酸を含む植物も提供する。]
[0094] インフルエンザ赤血球凝集素の発現および／または分泌中のＮ末端シグナルペプチド（ＳＰ）配列のプロセシングは、フォールディングプロセスに役割を有することが提唱されている。「シグナルペプチド」という用語は、一般的に、新たに翻訳されたポリペプチドの特定細胞小器官への移動を指示することができるか、またはポリペプチドの特異的ドメインの位置決めを支援することができる赤血球凝集素ポリペプチドのＮ末端で一般的に見出されるアミノ酸の短い配列（約５〜３０個のアミノ酸）を指す。赤血球凝集素のシグナルペプチドは、小胞体へのタンパク質の移動を標的としており、Ｎ末端近位ドメインを新生赤血球凝集素ポリペプチドの膜アンカードメインに対して位置決めすることを支援して、成熟赤血球凝集素の切断およびフォールディングを支援すると提唱されている。シグナルペプチドの除去には（例えばシグナルペプチダーゼによる）、シグナルペプチドを正確に切断および除去して成熟赤血球凝集素を提供することが必要である場合があり、この正確な切断は、シグナルペプチドの部分もしくは全体、切断部位に隣接するアミノ酸配列、シグナルペプチドの長さ、またはこれらの組合せを含むいくつかの要因のいずれかに依存する場合があり、すべての要因が所与の配列に当てはまらなくてもよい。]
[0095] シグナルペプチドは、発現されている赤血球凝集素に天然であってもよく、または組換え赤血球凝集素は、第１のインフルエンザ型、亜型、または菌株に由来するシグナルペプチドを、第２のインフルエンザ型、亜型、または菌株に由来する赤血球凝集素との均衡を保ちながら含む。例えば、ＨＡ亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、またはＢ型インフルエンザの天然ＳＰを、植物系でのＨＡ発現に使用することができる。]
[0096] また、シグナルペプチドは非天然であってもよく、例えばインフルエンザ以外のウイルスの構造タンパク質または赤血球凝集素に由来するか、または植物、動物、もしくは細菌ポリペプチドに由来してもよい。典型的なシグナルペプチドは、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩＳＰ）（受託番号Ｚ１１４９９のヌクレオチド３２〜１０３；配列番号３４；図１７；アミノ酸配列ＭＡＫＮＶＡＩＦＧＬＬＦＳＬＬＬＬＶＰＳＱＩＦＡＥＥ）のシグナルペプチドである。] 図１７
[0097] 本発明は、天然または非天然シグナルペプチドを含むインフルエンザ赤血球凝集素、およびそのような赤血球凝集素をコードする核酸も提供する。]
[0098] インフルエンザＨＡタンパク質は、分子量、等電点、サイズ、およびグリカン相補体などに関して、さまざまな範囲の類似性および差異を示す。種々の赤血球凝集素の物理化学的特性は、植物、昆虫細胞、または酵母系で発現されたＨＡ間の区別を可能にするのに有用であり得、複数のＨＡが単一の系で共発現される場合は特に有用であり得る。そのような物理化学的特性の例は、表１に提供されている。]
[0099] 本発明は、Ｈ１、Ｈ５、またはＨ７に由来するＨＡをコードするヌクレオチド配列、配列番号２８、配列番号３、配列番号１１も含む。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２８、配列番号３、配列番号１１とハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２８、配列番号３、配列番号１とハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。配列番号にハイブリダイズするこれらのヌクレオチド配列または配列番号の相補体は、発現時にＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは対象への投与時に抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、１つまたは複数のインフルエンザ型または亜型の成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。]
[0100] 本発明は、以下のヌクレオチド配列も含む：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、以下のものとハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、以下のものの相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。以下のものにハイブリダイズするこれらのヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは対象への投与時に抗体の産生を誘導する：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、もしくは配列番号４７、または配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、もしくは配列番号４７の相補体。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、１つまたは複数のインフルエンザ型または亜型の成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。]
[0101] いくつかの実施形態では、本発明は、以下のヌクレオチド配列も含む：Ａ型インフルエンザのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９亜型に由来するＨＡ、またはＢ型インフルエンザに由来するＨＡをコードする配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、以下のものとハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む：配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、以下のものの相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む：配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。以下のものにハイブリダイズするこれらのヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは対象への投与時に抗体の産生を誘導する：配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、もしくは配列番号４７、または配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、もしくは配列番号４７の相補体。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、１つまたは複数のインフルエンザ型または亜型の成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。]
[0102] ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下のハイブリダイゼーションは、当技術分野で公知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５年および増補；Ｍａｎｉａｔｉｓら、ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版２００１年）。１つのそのようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃で約１６〜２０時間４×ＳＳＣでハイブリダイゼーションし、その後６５℃で１時間０．１×ＳＳＣで洗浄、または６５℃で各々２０分もしくは３０分間０．１×ＳＳＣで２回洗浄してもよい。あるいは、典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣで４２℃終夜（１６〜２０時間）、その後６５℃で１時間０．１×ＳＳＣで洗浄、または６５℃で各々２０分もしくは３０分間または終夜（１６〜２０時間）０．１×ＳＳＣで２回洗浄、あるいは、Ｃｈｕｒｃｈ社製リン酸緩衝水溶液（７％ＳＤＳ；０．５Ｍ ＮａＰＯ４緩衝液ｐＨ７．２；１０ｍＭＥＤＴＡ）中６５℃でハイブリダイゼーションし、５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０もしくは３０分間各々洗浄、または６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０もしくは３０分間各々２回洗浄であってもよい。]
[0103] 加えて、本発明は、Ｈ１（配列番号２８）、Ｈ５（配列番号３）、またはＨ７（配列番号１１）に由来するＨＡをコードするヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはその間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有することを特徴とするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰ形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。]
[0104] 加えて、本発明は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７のヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはその間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有することを特徴とするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰ形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。]
[0105] 加えて、本発明は、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７のヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはその間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有することを特徴とするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰ形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。]
[0106] 同様に、本発明は、以下の亜型Ｈ１（配列番号２８によってコードされる）、Ｈ２（配列番号１２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号１３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号１４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号１５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号１６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号１１によってコードされる）、Ｈ８（配列番号１７によってコードされる）、Ｈ９（配列番号１８によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号１９によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号２０によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号２１によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号２７によってコードされる）、Ｈ１４（配列番号２３によってコードされる）、Ｈ１５（配列番号２４によってコードされる）、Ｈ１６（配列番号２５によってコードされる）、またはＢ型インフルエンザ（配列番号２６によってコードされる）；（図１０Ａ〜１０Ｏを参照）と結合するＨＡを含み、ならびにＨ１（配列番号２８）、Ｈ２（配列番号１２）、Ｈ３（配列番号１３）、Ｈ４（配列番号１４）、Ｈ５（配列番号１５）、Ｈ６（配列番号１６）、Ｈ７（配列番号１１）、Ｈ８（配列番号１７）、Ｈ９（配列番号１８）、Ｈ１０（配列番号１９）、Ｈ１１（配列番号２０）、Ｈ１２（配列番号２１）、Ｈ１３（配列番号２７）、Ｈ１４（配列番号２３）、Ｈ１５（配列番号２４）、Ｈ１６（配列番号２５）と、約７０〜１００％およびその間の任意の量、８０〜１００％およびその間の任意の量、９０〜１００％およびその間の任意の量、または９５〜１００％およびその間の任意の量の配列同一性を有することを特徴とするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰ形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。] 図１０Ａ 図１０Ｂ 図１０Ｃ 図１０Ｄ 図１０Ｅ 図１０Ｆ 図１０Ｇ 図１０Ｈ 図１０Ｉ 図１０Ｊ
[0107] 「免疫応答」は、一般的に適応免疫系の応答を指す。適応免疫系は、一般的に、体液性応答および細胞性応答を含む。体液性応答は、Ｂリンパ球系統（Ｂ細胞）の細胞で産生される抗体の分泌によって媒介される免疫の態様である。分泌された抗体は、侵入微生物（ウイルスまたは細菌など）の表面にある抗原と結合し、それらに破壊用の目印をつける。体液性免疫は、一般的に、抗体産生およびそれに伴うプロセス、ならびにＴｈ２細胞活性化およびサイトカイン産生を含む抗体のエフェクター機能、記憶細胞産生、食作用のオプソニン亢進、および病原体除去などを参照するために使用される。「調節する」または「調節」などという用語は、それらのいくつかが本明細書中で例示されている一般的に公知または使用されているいくつかのアッセイにより決定されるような、特定の応答またはパラメーターの増加または減少を指す。]
[0108] 細胞性応答は、抗体を伴わないが、むしろ抗原に応答してマクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異性的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、および種々のサイトカインの放出を伴う免疫応答である。細胞性免疫は、一般的に、ある程度のＴｈ細胞活性化、Ｔｃ細胞活性化、およびＴ細胞媒介性応答に言及するために使用される。細胞性免疫は、ウイルス感染に応答する際に特定に重要である。]
[0109] 例えば、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘導は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して測定することができ、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球の刺激は、増殖アッセイを使用して測定することができる。抗インフルエンザ抗体の力価は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量することができ、抗原特異的または交差反応性抗体のアイソタイプは、抗アイソタイプ抗体（例えば、抗ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）を使用して測定することもできる。そのようなアッセイを実施する方法および技術は、当技術分野において周知である。]
[0110] 赤血球凝集阻害（ＨＩ、またはＨＡＩ）アッセイを使用して、ワクチンまたはワクチン組成物により誘導された抗体の効力が、組換えＨＡによる赤血球（ＲＢＣ）の凝集反応を阻害することができることを実証することもできる。血清試料の血球凝集阻害性抗体力価は、マイクロタイターＨＡＩにより評価することができる（Ａｙｍａｒｄら、１９７３年）。例えば、ウマ、シチメンチョウ、またはニワトリなど、いくつかの種のいずれかに由来する赤血球を使用することができる。このアッセイは、ＶＬＰ表面でのＨＡ三量体構築に関する間接的な情報をもたらし、ＨＡの抗原性部位の適切な提示を確認する。]
[0111] 交差反応ＨＡＩ力価を使用して、ワクチン亜型と関係するウイルスの他の菌株に対する免疫応答の効力を実証することもできる。例えば、第１の菌種のワクチン組成物（例えば、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ５／０５のＶＬＰ）で免疫された対象に由来する血清を、第２の菌株（例えば、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）の全ウイルスまたはウイルス粒子と共にＨＡＩアッセイで使用し、ＨＡＩ力価を決定することができる。]
[0112] サイトカインの存在またはレベルを定量化することもできる。例えば、Ｔヘルパー細胞応答（Ｔｈ１／Ｔｈ２）は、ＥＬＩＳＡ（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社ＯｐｔＥＩＡキット）を使用してＩＦＮ−γおよびＩＬ−４分泌細胞を測定することにより特徴づけられるだろう。対象から得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）または脾細胞を培養し、上清を分析することができる。Ｔリンパ球は、マーカー特異的蛍光標識および当技術分野で公知の方法を使用して、蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）により定量化することもできる。]
[0113] マイクロ中和アッセイを実施して、対象における免疫応答を特徴づけることもできる。例えば、Ｒｏｗｅら、１９７３年の方法を参照されたい。ウイルス中和力価は、以下を含むいくつかの方法で取得することができる：１）細胞のクリスタルバイオレット固定／着色後の溶解プラークの計数（プラーク検定）；２）培養中の細胞融解に関する微視的観察；３）ＮＰウイルスタンパク質（宿主細胞のウイルス感染と相関する）のＥＬＩＳＡおよび分光光度的な検出。]
[0114] 配列同一性または配列類似性は、ＤＮＡＳＩＳ内で提供されているものなどのヌクレオチド配列比較プログラムを使用して（例えば、これらに限定されないが、以下のパラメーターを使用して：ギャップペナルティ５、トップ対角線の数（＃ ｏｆ ｔｏｐ ｄｉａｇｏｎａｌｓ）５、固定ＧＡＰペナルティ １０、ｋ−タプル２、遊動ギャップ １０、および窓サイズ５）決定することができる。しかしながら、比較用の配列アラインメントの他の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１年、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２巻：４８２頁）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８巻：４４３頁、１９７０年）、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻：２４４４頁）のアルゴリズムであり、これらのアルゴリズムのコンピューター化実装（例えばＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＢＬＡＳＴ）により、または手動アラインメントおよび目視検査による。]
[0115] 「赤血球凝集素ドメイン」という用語は、ＨＡ０ドメイン、またはＨＡ１およびＨＡ２ドメイン（あるいはＨＡ１およびＨＡ２断片と呼ばれる）のいずれかを含むペプチドを指す。ＨＡ０は、ＨＡ１およびＨＡ２断片の前駆体である。ＨＡモノマーは、一般的に、２つの機能的ドメイン、基部ドメインおよび球状頭部または頭部ドメインに細分化することができる。基部ドメインは、酸性ｐＨに免疫誘発されると起こす場合がある構造変化を介して、ウイルスの感染力および病原性に関与する。基部ドメインは、４つのサブドメインまたは断片：融合サブドメインまたはペプチド（酸性ｐＨ立体構造において宿主膜との融合に関与するアミノ酸の疎水性伸長）、基部サブドメイン（２つ以上の立体構造をとることができる）、膜貫通ドメインまたはサブドメイン（ＴｍＤ）（脂質ラフトに対するＨＡの親和性に関与する）、および細胞質尾部（細胞質尾部サブドメイン）（Ｃｔａｉｌ）（ＨＡの分泌に関与する）にさらに細分化することができる。球状頭部は、２つのサブドメイン、ＲＢサブドメイン、および痕跡エステラーゼドメイン（Ｅ）に分割される。Ｅサブドメインは、部分的にまたは完全に埋没しており、球状頭部の表面に露出していなくともよく、したがって、ＨＡに対するいくつかの抗体は、ＲＢサブドメインに結合する。]
[0116] 「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）または「ウイルス様粒子（複数）」または「ＶＬＰ（複数）」という用語は、自己組織化し、インフルエンザＨＡタンパク質などの構造タンパク質を含む構造を指す。ＶＬＰは、一般的に、感染に際して産生されるビリオンと形態学的および抗原性的に類似するが、複製するのに十分な遺伝情報を欠除しており、したがって非感染性である。いくつかの例では、ＶＬＰは、単一タンパク質種を含んでいてもよく、または複数タンパク質種を含んでいてもよい。複数のタンパク質種を含むＶＬＰの場合、タンパク質種は同じ種のウイルス由来であってもよく、または異なる種、属、亜科、または科のウイルス（ＩＣＴＶ命名法により命名されるような）に由来するタンパク質を含んでいてもよい。他の例では、ＶＬＰを構成するタンパク質種の１つまたは複数は、天然に存在する配列から修飾されていてもよい。ＶＬＰは、植物および昆虫宿主細胞を含む好適な宿主細胞中で生産することができる。宿主細胞からの抽出後、単離し、好適な条件下でさらに単離すると、ＶＬＰは完全な構造で精製することができる。]
[0117] 本発明に従ってインフルエンザ由来タンパク質から生産されたＶＬＰは、Ｍ１タンパク質を含んでいない。Ｍ１タンパク質は、ＶＬＰ調製の不純物であるＲＮＡと結合することが公知である（ＷａｋｅｆｉｅｌｄおよびＢｒｏｗｎｌｅｅ、１９８９年）。ＲＮＡの存在は、ＶＬＰ生産の規制認可を取得する場合に望ましくなく、したがって、ＲＮＡを欠くＶＬＰ調製は有利であり得る。]
[0118] 本発明のＶＬＰは、タンパク質にシアル酸を付加する能力を欠くことを特徴とする宿主細胞中、例えば、植物細胞、昆虫細胞、真菌、および他の生物、海綿、腔腸動物（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｒａ）、環形動物、節足動物（ａｒｔｈｏｒｏｐｏｄａ）、軟体動物、線形動物、輪形動物（ｔｒｏｃｈｅｌｍｉｎｔｅｓ）、扁形動物、毛顎動物、半索動物、クラミジア、スピロヘータ、グラム陽性菌、シアノバクテリア、または古細菌などで生産することができる。例えば、Ｇｌｙｃｏｆｏｒｕｍ（ＵＲＬ：ｇｌｙｃｏｆｏｒｕｍ．ｇｒ．ｊｐ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｗｏｒｄ／ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ／ＥＳ−Ａ０３Ｅ．ｈｔｍｌ）；またはＧｕｐｔａら、１９９９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ２７巻：３７０〜３７２頁；またはＴｏｕｋａｃｈら、２００７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３５巻：Ｄ２８０〜Ｄ２８６頁；またはＵＲＬ：ｇｌｙｃｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．ｊｐ（Ｎａｋａｈａｒａら、２００８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６巻：Ｄ３６８〜Ｄ３７１頁；ｄｏｉ：１０．１０９３／ＮＡＲ／ｇｋｍ８３３で２００７年１０月１１日にオンライン公表された）を参照されたい。本明細書中に記載のように生産されたＶＬＰは、典型的にはノイラミンダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｄａｓｅ）（ＮＡ）を含んでいない。しかしながら、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが所望の場合、ＮＡをＨＡと共発現させることができる。]
[0119] 本発明のいくつかの態様により植物中で生産されたＶＬＰは、植物由来脂質と複合体化していてもよい。ＶＬＰは、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２ペプチドを含んでいてもよい。植物由来脂質は、脂質二分子膜の形態であってもよく、ＶＬＰを包み込むエンベロープをさらに含んでいてもよい。植物由来脂質は、植物の原形質膜の脂質成分を含んでいてもよく、その場合、これらに限定されないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴ糖脂質、植物ステロール、またはそれらの組合せを含むＶＬＰが生産される。植物由来脂質は、あるいは「植物脂質」と呼ばれる場合がある。植物ステロールの例は当技術分野で公知であり、例えば、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロール、およびコレステロールが含まれる。例えば、Ｍｏｎｇｒａｎｄら、２００４年を参照されたい。]
[0120] ＶＬＰは、例えば、血球凝集アッセイ、電子顕微鏡法、またはサイズ排除クロマトグラフィーにより、構造およびサイズを評価することができる。]
[0121] サイズ排除クロマトグラフィーの場合、凍結粉砕された植物物質の試料を抽出緩衝液中でホモジナイズし（Ｐｏｌｙｔｒｏｎで）、不溶性物質を遠心分離により取り除くことによって、総可溶性タンパク質を植物組織から抽出することができる。ＰＥＧを用いた析出も有用であり得る。可溶性タンパク質を定量化し、抽出物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）カラムに流す。ブルーデキストラン２０００を検量基準として使用することができる。クロマトグラフィー後、画分を免疫ブロット法によりさらに分析して、画分のタンパク質補体を決定する。]
[0122] 理論により束縛されることは望まないが、異なる動物に由来するＲＢＣに結合するＨＡの能力は、シアル酸α２，３またはα２，３に対するＨＡの親和性、およびＲＢＣ表面のこれらのシアル酸の存在により決定される。インフルエンザウイルスに由来するウマおよびトリＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒト、ヒツジ、ウマ、およびウシを含むいくつかの種すべてに由来する赤血球を凝集させるが、ヒトＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒト、およびヒツジの赤血球に結合するだろう（Ｉｔｏ Ｔ．ら、１９９７年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２２７巻、４９３〜４９９頁；およびＭｅｄｅｉｒｏｓ Ｒら、２００１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２８９巻、７４〜８５頁）。異なるインフルエンザ菌株のＨＡの種反応性の例は、表２Ａおよび２Ｂに示されている。]
[0123] タンパク質、融合タンパク質、またはポリペプチドの断片または部分は、断片が発現時にＶＬＰを形成することができれば、特定のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸相補体のサブセットを含むペプチドまたはポリペプチドを含む。断片は、例えば、抗原性領域、ストレス応答誘導領域、またはタンパク質もしくはポリペプチドの機能的ドメインを含む領域を含んでいてもよい。断片は、同じ一般ファミリーのタンパク質に共通した領域またはドメインも含むこともでき、または断片は、それが由来する全長タンパク質を特異的に識別するのに十分なアミノ酸配列を含むことができる。]
[0124] 例えば、断片または部分は、断片が発現時にＶＬＰを形成することができれば、タンパク質の全長の長さの約６０％から約１００％まで、またはその間の任意の量を含んでいてもよい。例えば、タンパク質の全長の長さの約６０％から約１００％まで、約７０％から約１００％まで、約８０％から約１００％まで、約９０％から約１００％まで、約９５％から約１００％まで、またはその間の任意の量。あるいは、断片または部分は、断片が発現時にＶＬＰを形成することができれば、ＨＡに依存して、約１５０から約５００個のアミノ酸またはその間の任意の量であってもよい。例えば、断片は、断片が発現時にＶＬＰを形成することができれば、ＨＡに依存して、約１５０から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約２００から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約２５０から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約３００から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約３５０から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約４００から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約４５０から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量であってもよい。例えば、約５、１０、２０、３０、４０、もしくは５０個のアミノ酸またはその間の任意の量は、断片が発現時にＶＬＰを形成することができれば、ＨＡのタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方から取り除かれてもよい。]
[0125] 任意の所与配列のアミノ酸の付番は特定の配列と比べてであるが、当業者であれば、構造および／または配列に基づき配列の特定のアミノ酸の「同等性」を容易に決定することができる。例えば、結晶学用のクローンを構築する際に、６個のＮ末端アミノ酸が取り除かれたとすると、これによりアミノ酸の特定の番号同一性が変更されるだろうが（例えばタンパク質の全長と比べて）、構造中のアミノ酸の相対的地位は変更されないだろう。]
[0126] 配列（複数可）の比較は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して行うことができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５巻：４０３〜４１０頁）。ＢＬＡＳＴ探索により、クエリー配列を、特定の配列または配列の群と、または配列のより大きなライブラリーもしくはデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎＰｅｐｔ）と比較することが可能であり、１００％の同一性を示す配列だけでなく、より低い度合いの同一性を有する配列も識別される。核酸またはアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して比較することができる。さらに、２つ以上の配列間の同一性は、配列を共にアラインさせ、配列間の％同一性を決定することにより決定することができる。アラインメントは、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／から利用可能なような；以下の初期設定パラメーターを使用：プログラム：ｂｌａｓｔｎ；データベース：ｎｒ；完全一致（Ｅｘｐｅｃｔ）１０；フィルター：初期設定；アラインメント：対毎；クエリー遺伝子コード：標準（１））、または初期設定パラメーター：マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２；フィルター：初期設定、エコーフィルター：オン、完全一致：１０、カットオフ：初期設定；鎖：両方；説明：５０、アラインメント：５０を使用した、ＥＭＢＬＵＲＬ：ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌからのＢＬＡＳＴ２；または初期設定パラメーターを使用するＦＡＳＴＡ）、または手動での配列比較および％同一性の計算によって、実行することができる。]
[0127] 本発明は、これらに限定されないが、ＨＡをコードする核酸を植物発現ベクターにクローニングすること、およびワクチン生産に好適な植物からインフルエンザＶＬＰを生産することを記述する。そのような核酸の例には、例えば、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスＨＡ（例えば配列番号６１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）（例えば配列番号６０）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（例えば配列番号３６、４８、６２）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（例えば配列番号３７、４９、６３）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）（例えば配列番号４２、５４、６４）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（例えば配列番号４３、５５、６５）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）（例えば配列番号４４、５６、６６）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）（例えば配列番号４５、５７、６７）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）（例えば配列番号４７、５９、６８）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）（例えば配列番号３８、５０、６９）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）（例えば配列番号３９、５１、７０）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）（例えば配列番号４６、５８、７１）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（例えば配列番号４０、５２、７２）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（例えば配列番号４１、５３、７３）。 これらの菌株の対応するクローンまたは構築物番号は、表１に提供されている。配列番号３６〜４７に対応する核酸配列は、図２８〜３９に例示されているように、型または亜型の各々のＨＡのコード配列に作動可能に連結された上流のプラストシアニンを含む。配列番号６０〜７３に対応する核酸配列は、図５１〜６４に例示されているように、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、ＨＡの赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲ、ならびにターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットを含む。] 図２８ 図２９ 図３０ 図３１ 図３２ 図３３ 図３４ 図３５ 図３６ 図３７
[0128] ＶＬＰを使用して、形質転換された宿主細胞、例えば植物細胞または昆虫細胞において、サブウイルスインフルエンザ粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む機能的および免疫原性の同型巨大分子タンパク質構造へと自己組織化する組換えインフルエンザ構造タンパク質で構成される試薬を生産することもできる。]
[0129] したがって、本発明は、ＶＬＰおよび、植物発現系において単一エンベロープタンパク質の発現からウイルスＶＬＰを生産するための方法を提供する。ＶＬＰは、インフルエンザＶＬＰ（複数可）あるいは、これらに限定されないが、麻疹、エボラ、マールブルク、およびＨＩＶを含む他の原形質膜由来ウイルスから生産されるＶＬＰ（複数可）であってもよい。]
[0130] これらに限定されないが、当業者であれば公知であるように、以下の他のエンベロープウイルスに由来するタンパク質も使用することができる：フィロウイルス科（例えばエボラウイルスまたはマールブルグウイルスなど）、パラミクソウイルス科（例えば、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、ＲＳウイルス、またはニューモウイルスなど）、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒト免疫不全ウイルス２、またはヒトＴ細胞性白血病ウイルス１など）、フラビウイルス科（例えば、西ナイル脳炎、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、または黄熱ウイルスなど）、ブンヤウイルス科（例えばハンタウイルスなど）、コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス、またはＳＡＲＳなど）。原形質膜由来ウイルスで発現することができる抗原の非限定的な例には、ＨＩＶのカプシドタンパク質−ｐ２４；ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０もしくはｇｐ４１、エボラウイルスのＶＰ３０およびＶＰ３５、またはマールブルクのＧｐ／ＳＧＰ、または麻疹パラミクソウイルスのＨタンパク質もしくはＦタンパク質を含むフィロウイルスタンパク質が含まれる。例えば、ＨＩＶのＰ２４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：１９１７２９４８）は、ＨＩＶウイルスゲノムのｇａｇ配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：９６２９３５７）の翻訳および切断により得られるタンパク質であり、ＨＩＶのｇｐ１２０およびｇｐ４１は、ＨＩＶウイルスゲノムのｅｎｖによってコードされるｇｐ１６０タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：９６２９３６３）の翻訳および切断により得られる糖タンパク質である。エボラウイルスのＶＰ３０（ＧｅｎＰｅｐｔ参照ｇｉ：５５７７０８１３）は、エボラウイルスゲノムのｖｐ３０配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：５５７７０８０７）の翻訳により得られるタンパク質であり、エボラウイルスのＶＰ３５（ＧｅｎＰｅｐｔ参照ｇｉ：５５７７０８０９）は、エボラウイルスゲノムのｖｐ３５配列の翻訳により得られるタンパク質である。マールブルグウイルスのＧｐ／ＳＧＰ（ＧｅｎＰｅｐｔ参照ｇｉ：２９６９６５）は、マールブルグウイルスゲノムの（配列）（ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：１５８５３９１０８）の翻訳により得られるタンパク質である。Ｈタンパク質（ＧｅｎＰｅｐｔ参照ｇｉ：９６２６９５１）は、麻疹ウイルスゲノムのＨ配列（ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：９６２６９４５）のタンパク質であり、Ｆタンパク質（ＧｅｎＰｅｐｔ参照ｇｉ：９６２６９５０）は、麻疹ウイルスゲノムのＦ配列のタンパク質である。]
[0131] しかしながら、当業者であれば公知であるように、他のエンベロープタンパク質を、本発明の方法内で使用することができる。]
[0132] したがって、本発明は、ＨＩＶ−ｐ２４、ＨＩＶ−ｇｐ１２０、ＨＩＶ−ｇｐ４１、エボラウイルス−ＶＰ３０、エボラウイルス−ＶＰ３５、マールブルグウイルＧｐ／ＳＧＰ、麻疹ウイルス−Ｈタンパク質または−Ｆタンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。核酸分子は、昆虫、酵母、または植物細胞において、または特定の植物組織において活性のある調節領域に作動可能に連結されていてもよい。]
[0133] 本発明は、ＨＡ、例えばこれらに限定されないが、ヒトインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ウイルスＨＡ（Ｈ５Ｎ１）をコードする核酸を、植物または昆虫の発現ベクター（例えば、バキュロウイルス発現ベクター）にクローニングすること、および形質転換された植物細胞または形質転換された昆虫細胞において、機能的および免疫原性の同型巨大分子タンパク質構造へと自己組織化する、サブウイルスインフルエンザ粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む組換えインフルエンザ構造タンパク質を含むインフルエンザワクチン候補または試薬の生産をさらに提供する。]
[0134] インフルエンザ亜型、例えば、これらに限定されないが、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６のＨＡをコードする核酸は、例えば、適切な細胞系統、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えば、Ｓｆ−９細胞系統；ＡＴＣＣＰＴＡ−４０４７）においてバキュロウイルス発現系を使用して発現することができる。他の昆虫細胞系統も使用することができる。]
[0135] あるいは、ＨＡをコードする核酸は、植物細胞または植物において発現することができる。ＨＡをコードする核酸は、ＨＡ ＲＮＡを使用する逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成することができる。一例として、ＲＮＡは、ヒトインフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスもしくはヒトインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルス、または他のインフルエンザウイルス、例えばＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６から単離されてもよく、またはインフルエンザウイルスに感染した細胞から単離されてもよい。逆転写およびＰＣＲの場合、ＨＡ ＲＮＡ、例えば、これらに限定されないが、ヒトインフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスＨＡ配列もしくはヒトインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスＨＡ０配列、またはインフルエンザ亜型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。加えて、ＨＡをコードする核酸は、当業者であれば公知である方法を使用して、化学的に合成することができる。]
[0136] その結果生じるこれらの遺伝子のｃＤＮＡコピーを、宿主発現系により必要とされる好適な発現ベクターにクローニングすることができる。植物用の適切な発現ベクターの例は下記に記載されており、あるいは公知の方法を使用してｐＦａｓｔＢａｃｌに基づくプラスミドに帰着するバキュロウイルス発現ベクター、例えばｐＦａｓｔＢａｃｌ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製）であり、製造業者の説明書により提供される情報を使用してもよい。]
[0137] 本発明は、上述のように、植物において活性のある調節エレメントに作動可能に連結されたＨＡをコードする核酸を含む遺伝子構築物に関する。植物細胞において作動可能であり、本発明により使用することができる調節エレメントの例には、これらに限定されないが、プラストシアニン調節領域（米国特許第７，１２５，９７８号；参照により本明細書に組み込まれる）、またはリブロース１，５ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ；米国特許第４，９６２，０２８号；参照により本明細書に組み込まれる）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ；Ｌｅｕｔｗｉｌｅｒら；１９８６年；参照により本明細書に組み込まれる）、ＳＴ−ＬＳ１（光化学系ＩＩの酸素発生複合体と結合、Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら、１９８７年、１９８９年に記載；参照により本明細書に組み込まれる）の調節領域が含まれていてもよい。プラストシアニン調節領域の一例は、配列番号３６のヌクレオチド１０〜８５を含む配列、または配列番号３７〜４７のいずれか１つの類似領域である。調節エレメントまたは調節領域は、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の翻訳を増強することができ、ヌクレオチド配列はタンパク質またはポリペプチドをコードしていてもよい。調節領域の別の例は、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の非翻訳領域に由来する調節領域であり、それが作動可能に連結されるヌクレオチド配列を優先的に翻訳するために使用することができる。このＣＰＭＶ調節領域は、ＣＭＰＶ−ＨＴ系を含む。例えば、Ｓａｉｎｓｂｕｒｙら、２００８年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １４８巻：１２１２〜１２１８頁を参照されたい。]
[0138] 構築物が昆虫細胞で発現される場合、昆虫細胞で作動可能な調節エレメントの例には、これらに限定されないが、ポリヘドリンプロモーター（ＰｏｓｓｅｅおよびＨｏｗａｒｄ１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ １５巻：１０２３３〜１０２４８頁）、およびｇｐ６４プロモーター（Ｋｏｇａｎら、１９９５年、Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９巻：１４５２〜１４６１頁）などが含まれていてもよい。]
[0139] したがって、本発明の態様は、調節領域とインフルエンザＨＡをコードする配列とを含む核酸を含む。調節領域は、プラストシアニン調節エレメントであってもよく、インフルエンザＨＡは、以下を含むインフルエンザ菌株または亜型の群から選択されてもよい：Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９ （Ｈ９Ｎ２）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６。プラストシアニン調節エレメントおよびインフルエンザＨＡを含む核酸配列は、配列番号３６〜４７により本明細書中に例示されている。]
[0140] インフルエンザウイルスが卵または哺乳動物細胞（例えばＭＤＣＫ細胞）で培養される場合、または感染した対象から単離される場合、インフルエンザ赤血球凝集素アミノ酸配列またはそれらをコードする核酸の配列には配列差がある場合があることは公知である。そのような差異の非限定的な例は、実施例１８を含めて、本明細書中に例示されている。さらに、当業者であれば理解するだろうが、追加的な突然変異は生じ続けるため、追加的な変異が、新しい菌株から得られるインフルエンザ赤血球凝集素内に観察される場合がある。異なるインフルエンザ赤血球凝集素間の公知の配列変異のため、本発明は、本明細書中に記載されているような宿主中で発現される際に、インフルエンザ赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ）がＶＬＰを形成しさえすれば、いかなるインフルエンザ赤血球凝集素を使用して作製されてもよいＶＬＰを含む。]
[0141] 配列アラインメントおよびコンセンサス配列は、当技術分野で公知のいくつかのソフトウェアパッケージのいずれか、例えば、ＭＵＬＴＡＬＩＮ（Ｆ． ＣＯＲＰＥＴ、１９８８年、Ｎｕｃｌ． ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１６巻（２２号）、１０８８１〜１０８９０頁）を使用して決定してもよく、または配列は、手動でアラインして配列間の類似性および差異を決定してもよい。]
[0142] 赤血球凝集素の構造は十分に研究されており、構造は高度に保存されていることが公知である。赤血球凝集素構造を重ね合わせると、高度な構造保存が観察される（ｒｍｓｄ＜２Ａ）。この構造保存は、アミノ酸配列がいくつかの位置で異なる場合があっても観察されている（例えば、ＳｋｅｈｅｌおよびＷｉｌｅｙ、２０００年、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６９巻：５３１〜６９頁；Ｖａｃｃａｒｏら、２００５年）。赤血球凝集素の領域も十分に保存されており、以下がその例である：
・構造ドメイン：ＨＡ０ポリタンパク質は切断されて成熟ＨＡを提供する。ＨＡは、単一のジスルフィド結合により連結された受容体結合ドメイン（ＨＡ１）および膜アンカードメイン（ＨＡ２）を含む各モノマーを有するホモ三量体であり、ＨＡ２サブユニットのＮ末端２０残基は、ＨＡ融合ドメインまたは配列と呼ばれる場合もある。また、「尾部」領域（膜エンベロープの内部）も存在する。各赤血球凝集素は、これらの領域またはドメインを含む。個々の領域またはドメインは、典型的には長さが保存されている。]
[0143] ・赤血球凝集素はすべて、同じ数および位置の分子内および分子間ジスルフィド架橋を含有している。ジスルフィド架橋ネットワークに関与するシステインの、アミノ酸配列における数および位置は、ＨＡ中で保存されている。特徴的な分子内および分子間ジスルフィド架橋ならびに他の保存されたアミノ酸ならびにそれらの相対的地位を例示する構造の例は、例えばＧａｍｂｌｉｎら、２００４年（Ｓｃｉｅｎｃｅ３０３巻：１８３８〜１８４２頁）に記載されている。典型的な構造および配列には、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋから入手可能な１ＲＶＺ、１ＲＶＸ、１ＲＶＴ、１ＲＶ０、１ＲＵＹ、１ＲＵ７が含まれる（Ｂｅｒｍａｎら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０巻：９８０頁；ＵＲＬ：ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）。]
[0144] ・細胞質尾部−大多数の赤血球凝集素は保存された位置に３つのシステインを含む。これらのシステインの１つまたは複数は、翻訳後修飾としてパルミトイル化される場合がある。]
[0145] アミノ酸変異は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素では許容されている。この変異は、絶えず同定されている新しい菌株を提供する。新しい菌株間の感染力は変動する場合がある。しかしながら、その後にＶＬＰが形成される赤血球凝集素三量体の形成は、維持される。したがって、本発明は、植物中でＶＬＰを形成する赤血球凝集素アミノ酸配列または赤血球凝集素アミノ酸配列をコードする核酸を提供するものであり、公知の配列および発生する場合のある変異配列を含む。]
[0146] 図６５は、そのような公知の変異の例を例示している。この図は、以下のＨ１Ｎ１菌株のＨＡのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号７４）を示す：
Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号３３によってコードされる）、
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４８）、
Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４９）、および
配列番号９。ここでＸ１（３位）はＡまたはＶでありＸ２（５２位）はＤまたはＮであり、Ｘ３（９０位）はＫまたはＲであり、Ｘ４（９９位）はＫまたはＴであり、Ｘ５（１１１位）はＹまたはＨであり、Ｘ６（１４５位）はＶまたはＴであり、Ｘ７（１５４位）はＥまたはＫであり、Ｘ８（１６１位）はＲまたはＫであり、Ｘ９（１８１位）はＶまたはＡであり、Ｘ１０（２０３位）はＤまたはＮであり、Ｘ１１（２０５位）はＲまたはＫであり、Ｘ１２（２１０位）はＴまたはＫであり、Ｘ１３（２２５位）はＲまたはＫであり、Ｘ１４（２６８位）はＷまたはＲであり、Ｘ１５（２８３位）はＴまたはＮであり、Ｘ１６（２９０位）はＥまたはＫであり、Ｘ１７（４３２位）はＩまたはＬであり、Ｘ１８（４８９位）はＮまたはＤである。] 図６５
[0147] そのような変異の別の例として、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号３３によってコードされる）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４８）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４９）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、および配列番号９のＨＡの配列アラインメントおよびコンセンサス配列は、下記の表３に示されている。]
[0148] ]
[0149] コンセンサス配列は、指定の位置ですべての配列に共通の大文字アミノ酸で示されており、小文字は、配列の少なくとも半分または大多数に共通のアミノ酸を示し、！という記号はＩまたはＶのいずれか１つであり、＄という記号はＬまたはＭのいずれか１つであり、％という記号はＦまたはＹのいずれか１つであり、＃という記号は、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｂ、またはＺのいずれか１つであり、「．」という記号はアミノ酸がないことであり（例えば、欠失）、３位のＸはＡまたはＶのいずれか１つであり、５２位のＸはＥまたはＮのいずれか１つであり、９０位のＸはＫまたはＲであり、９９位のＸはＴまたはＫであり、１１１位のＸはＹまたはＨのいずれか１つであり、１４５位のＸはＶまたはＴのいずれか１つであり、１５７位のＸはＫまたはＥであり、１６２位のＸはＲまたはＫであり、１８２位のＸはＶまたはＡであり、２０３位のＸはＮまたはＤであり、２０５位のＸはＲまたはＫであり、２１０位のＸはＴまたはＫであり、２２５位のＸはＫまたはＹであり、３３３位のＸはＨまたは欠失であり、４３３位のＸはＩまたはＬであり、４９位のＸはＮまたはＤである。]
[0150] そのような変異の別の例として、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（配列番号５５）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）（配列番号１０）のＨＡの配列アラインメントおよびコンセンサス配列が、下記の表４に示されている。]
[0151] ]
[0152] コンセンサス配列は、指定の位置ですべての配列に共通の大文字アミノ酸で示されており、小文字は、配列の少なくとも半分または大多数に共通のアミノ酸を示し、！という記号はＩまたはＶのいずれか１つであり、＄という記号はＬまたはＭのいずれか１つであり、％という記号はＦまたはＹのいずれか１つであり、＃という記号は、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｂ、またはＺのいずれか１つであり、１０２位のＸはＴ、Ｖ、またはＡのいずれかであり、１１０位のＸはＳ、Ｄ、またはＮのいずれかであり、１５６位のＸはＳ、Ｋ、またはＴのいずれかである。]
[0153] 上記で例示および記載されているアラインメントおよびコンセンサス配列は、本発明の種々の実施形態で、植物中におけるＶＬＰの生産に使用することができる赤血球凝集素アミノ酸配列の変異体の非限定的な例である。]
[0154] アミノ酸配列をコードする核酸は、各アミノ酸のコドンが当技術分野で公知であるため、容易に決定することができる。したがって、アミノ酸配列が提供されることにより、それをコードする縮重核酸配列が教示される。したがって、本発明は、本明細書中に記載されているそれらのインフルエンザ菌株および亜型（例えば、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１９９５、Ａ／ｈｅｒｒｉｎｇ ｇｕｌｌ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３２／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＭＮ／３３／００、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２０００、Ａ／ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｐｉｎｔａｉｌ／ＴＸ／８２８１８９／０２、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｓｈｏｖｅｌｅｒ／Ｉｒａｎ／Ｇ５４／０３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／Ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、Ｃ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／６６、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ １０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））の赤血球凝集素をコードする核酸配列、ならびに上記の赤血球凝集素をコードする縮重配列を提供する。]

权利要求:

請求項1
植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
請求項2
前記ＨＡが、天然または非天然シグナルペプチドを含む、請求項１に記載の核酸。
請求項3
前記非天然シグナルペプチドが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドである、請求項２に記載の核酸。
請求項4
前記ＨＡが、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザであるか、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザの亜型である、請求項１に記載の核酸。
請求項5
前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である、請求項１に記載の核酸。
請求項6
インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法であって、ａ）請求項１に記載の核酸を該植物または該植物の部分に導入する工程と、ｂ）該核酸の発現を可能にする条件下で該植物または該植物の部分をインキュベートし、それにより該ＶＬＰを生産する工程とを含む方法。
請求項7
前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が、前記植物中で一過性に発現される、請求項６に記載の方法。
請求項8
前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が、前記植物中で安定的に発現される、請求項６に記載の方法。
請求項9
ｃ）宿主を回収し、前記ＶＬＰを精製する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
請求項10
前記導入工程（工程ａ）において、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸が、前記植物に導入される、請求項６に記載の方法。
請求項11
前記１つまたは複数のシャペロンタンパク質が、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
請求項12
インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法であって、ａ）請求項１に記載の核酸を含む植物または植物の部分を準備する工程と、ｂ）該核酸の発現を可能にする条件下で該植物または該植物の部分をインキュベートし、それにより該ＶＬＰを生産する工程とを含む方法。
請求項13
請求項１に記載の核酸を含む植物。
請求項14
植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、請求項１３に記載の植物。
請求項15
前記１つまたは複数のシャペロンタンパク質が、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択される、請求項１４に記載の植物。
請求項16
インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質および植物に由来する１つまたは複数の脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
請求項17
前記ＨＡが、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡの亜型である、請求項１６に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
請求項18
前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である、請求項１７に記載のＶＬＰ。
請求項19
有効用量の請求項１６に記載のＶＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
請求項20
対象においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、請求項１６に記載のウイルス様粒子を投与することを含む方法。
請求項21
前記ウイルス様粒子が、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下で、対象に投与される、請求項２０に記載の方法。
請求項22
植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾Ｎ−グリカンを保持するインフルエンザウイルスＨＡを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
請求項23
前記ＨＡが、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザであるか、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡの亜型である、請求項２２に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
請求項24
前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である、請求項２３に記載のＶＬＰ。
請求項25
有効用量の請求項２２に記載のＶＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
請求項26
対象においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、請求項２５に記載の組成物を投与することを含む方法。
請求項27
前記組成物が、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下で、対象に投与される、請求項２６に記載の方法。